遺伝性凝固線溶系蛋白欠損症の発症機転としての変異蛋白の細胞内輸送障害

突变蛋白的细胞内转运受损是遗传性凝血和纤溶蛋白缺陷的发病机制

基本信息

批准号：
05253207
负责人：
青木延雄
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アルファ2プラスミンインヒビター(以下α2PI)の先天性遺伝性欠損症の成因の一つとして、1アミノ酸(137番のグルタミン酸)の欠失がある。この1アミノ酸の欠失により、産生されたα2PIの細胞内輸送が障害され、血中に分泌されないため欠損症が生じることを既に報告した。この137番目のアミノ酸を置換したり、その周辺のアミノ酸を欠失させた場合、産生されたタンパクの細胞内輸送や分泌にどのような影響が及ぼされるかを検討した。137番のグルタミン酸に他のアミノ酸が置換するように、また、117,127,132,147,157,177番のアミノ酸がそれぞれ欠失するように、遺伝子変異を発現ベクターに導入しCOS7細胞にトランスフェクトした。48時間培養後、培養上清のα2PIを免疫学的に測定した。一方、培養後、放射活性標識メチオニンでパルスラベルし、時間を追って、細胞内および培養上清中のα2PIを免疫沈降後、SDS電気泳動、オートラジオグラフィーで測定した。137番の置換では、システインに置換した場合を除いては、著しい分泌の低下はみられなかった。127,132,137番のそれぞれのアミノ酸の欠失では、α2PIの分泌は正常α2PIのそれの10%ないし20%に低下していた。147番のアミノ酸欠失では低下は50%にとどまり、117,157,177番のそれぞれのアミノ酸欠失では、正常にくらべ有意の分泌低下はみられなかった。パルスラベルの実験結果は、タンパクの細胞内輸送が障害され、細胞内に停滞したタンパクが徐々に細胞内で崩壊されるため、分泌の低下が起きることを示した。これらの結果は、125付近から150付近の狭い領域がα2PIの細胞内輸送においてタンパク構造上重要な役割を演じていることを示している。

α2纤溶酶抑制剂（以下称为α2PI）的先天性遗传缺乏的原因之一是缺失一种氨基酸（谷氨酸编号137）。我们已经报道说，这种氨基酸的缺失会损害产生的α2Pi的细胞内转运，而不会分泌到血液中，从而导致缺乏。我们研究了如何删除137位或周围区域的氨基酸的氨基酸，以及第137位位置的氨基酸对产生蛋白质的细胞内转运和分泌的影响。将基因突变引入了表达载体中，并将其转染到COS7细胞中，以便将其他氨基酸替换为谷氨酸数字137，氨基酸数117、127、127、132、147、157和177被删除。孵育48小时后，通过免疫学测量了培养上清液的α2PI。另一方面，培养后，用放射性标记的蛋氨酸将α2Pi脉冲标记，然后在细胞和培养上清液中对α2PI进行免疫沉淀，然后通过SDS电泳和自显影测量。第137号的替代表明，除了更换半胱氨酸外，分泌物没有显着降低。在删除每个氨基酸数127,132,137中，α2PI分泌降至正常α2PI的分泌量的10％至20％。对于147的氨基酸缺失，减少仅为50％，在117、157和177处的氨基酸缺失没有明显的分泌降低。脉冲标签的实验结果表明，蛋白质的细胞内转运受损，细胞内蛋白质逐渐停滞在细胞内，导致分泌的下降。这些结果表明，大约125至150的狭窄区域在α2PI的细胞内转运中起关键的蛋白质结构作用。