血液凝固・線溶調節因子の分子生物学的研究

凝血纤溶调节剂的分子生物学研究

基本信息

批准号：
01637002
负责人：
青木延雄
金额：
$ 15.36万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.線溶制波因子アルファ2プラスミンインヒビター(PI)の先天性遺伝性欠損症の遺伝子について、昨年度に解明した家系と異った他の一家系について、その変異を明らかにした。その家系のホモ接合体の解析で遺伝子に再構成や大きな欠落はみとめられず、推一の変化としてGlu137に対応する3塩基対の欠落がみとめられた。この欠落は合成ヌクレオチドをプローブとしたハイブリド形成法にて、ヘテロ接合体にもみとめられた。また、発現実験によって、変異PIが細胞内が産生されるが細胞内移送が障害され分泌されないことが本家系PI欠損症の成因であることが判明した。2.凝固線溶制御調節因子ヒスチジンリッチ糖蛋白(HRG)の主要な性質の1つであるヘパリン中和作用と機能ドメインについてキモトリプシンによる限定分解とモノクローナル抗体による競合で検討した。その結果、HRGがヘパリン中和作用を発揮するためのヘパリン結合部位はN末端領域のシスタチン様ドメイン中に存在することが明らかになった。3.凝固のプロテインCを介する制御系において補酵素的役割を果たす血管内皮蛋白トロンボモデュリン(TM)の機能ドメインの解析を行なった。cDNAを用いて、site-directed deletion mutagenesis法により、6個のEGFドメインを含む蛋白を発現させ、それらのプロテインC活性化能をしらべた結果、活性の発現に必要な最小構造はEGF4、5、6であることが認められた。4プロテインC(PC)欠損家系のPC遺伝子のエクソン3、4、5断片においてメチル化のパターンが正常のそれと異なることが見出されたが、その違いがPC発現異常に関与しているとは現段階では立証できていない。5.凝固線溶の調節因子でもあるアルファ2マクログロブリン(MG)の遺伝子プロモーターをCAT遺伝子と融合し、肝細胞にトランスフェクトし、急性期への応答をになうMG遺伝子上のシグナルの位置と配列を決定した。

1. 关于纤溶波控制因子α2纤溶酶抑制剂（PI）先天性遗传缺陷基因，我们澄清了与去年阐明的家族不同的另一个家族的突变。对该家族中纯合子的分析显示，该基因没有重排或重大缺失，最可能的变化是对应于 Glu137 的 3 个碱基对的缺失。使用合成核苷酸作为探针的杂交方法也在杂合子中观察到这种缺失。此外，表达实验表明，突变型PI虽然是在细胞内产生，但细胞内转运受损，无法分泌，这也是导致原始PI缺乏的原因。 2. 通过胰凝乳蛋白酶的有限降解和与单克隆抗体的竞争，研究了富含组氨酸的糖蛋白（HRG）（一种凝血和纤溶调节剂）的肝素中和作用和功能域。结果表明，HRG发挥肝素中和作用的肝素结合位点存在于N末端区域的半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域中。 3. 我们分析了血栓调节蛋白（TM）的功能域，血栓调节蛋白是一种血管内皮蛋白，在蛋白 C 介导的凝血控制系统中发挥辅酶作用。我们利用cDNA，通过定点缺失诱变表达了含有6个EGF结构域的蛋白质，并检查了它们激活蛋白C的能力。结果，我们发现表达活性所需的最小结构是EGF4，5，6 。 4发现蛋白C（PC）缺陷家族中PC基因外显子3、4和5片段的甲基化模式与正常家族不同，但尚不清楚这种差异是否与异常PC表达有关。现阶段尚未得到证实。 5.将α2巨球蛋白（MG）的基因启动子与CAT基因融合并转染至肝细胞中，以确定MG基因上触发对凝血和纤维蛋白溶解的反应的信号的位置。确定了急性期的顺序。