Gunnラットへの遺伝子導入による先天性黄疸の解明と治療の基礎研究

基因导入Gunn大鼠阐明和治疗先天性黄疸的基础研究

基本信息

批准号：
04260213
负责人：
金田安史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04260213/
关键词：
遺伝子治療 HVJ-liposome Gunnラット先天性黄疸ビリルビンUDPGT

项目摘要

先天性黄疸のモデル動物であるGunnラットを用いて原因遺伝子の解明と治療を目ざして月究を行なった。その原因は肝臓におけるグルクロン酸抱合に関わる酵素(UDPGT)の異常であるが、我々はそのうちの1つビリルビンUDPGTをラット肝cDNAライブラリーよりクローニングし,Gunnラットにおける変異についても解明した。今年度には、ビリルビンUDPGTのRFLPを分離し、マウス第一染色体のposition37にマップすることに成功した。このビリルビンUDPGTcDNAのGunnラットへの導入により先天性黄疸の治療を試みるため、このcDNAを強力に発現できるベクトターの構築,発現した酵素量を測定するための抗体の分離、invivoへの遺伝子導入法の改良を行なった。UDPGTcDNAをCMUエンハンサーとchick beta actin promoterをもつ発現ベクターに組込み、CHO細胞に電気パルスで導入し、48hr後に、UDPGTの発現を薄層クロマトグラフィーで確認できた。一方、抗体作成のためN末15アミノ酸の合成ペプチドを家兎に免疫し抗体を得た。この抗体が肝の小胞体膜蛋白中のUDPGTを認識するかどうか検索中である。invivoへの遺伝子導入については以前より我々がHVJ-liposome法として既に成果をあゲてきた。インスリン、B型肝炎ウイルス蛋白、レニンのラット肝での発現に成功している。肝細胞での発現を裏付けるために、今回我々は肝細胞特異的なpyruvate kinaseのプロモーターとエンハンサーを用いて肝臓での発現とインスリンによる発現の誘導に成功した。in vivo遺伝子発現の難導は、発現が一過性であることだが、その克服のために1週間に1度ずつ注入をくり返することにより約1ヶ月の特続発現に成功した。以上、今年度は研究目的のための基礎実験を行ない、各々成果をあゲ、研究の資材、方法等、準備が整った状況である。

每月研究使用Gunn大鼠（一种用于先天性黄疸的模型动物），目的是阐明和治疗因果基因。原因是来自大鼠肝脏cDNA文库的酶（UDPGT）中涉及葡萄糖醛酸化（UDPGT）的酶异常，我们将其中一种，胆红素UDPGT克隆，也阐明了Gunn大鼠中的突变。今年，我们成功地隔离了胆红素UDPGT的RFLP，并将其映射到小鼠染色体的第37位，以试图通过将胆红素UDPGT cDNA引入gunn大鼠来治疗先天性黄疸，我们已经构建了一种构建了这种cdna剧烈的抗体，并构建了一种分离的抗体，并将其分离出来，并衡量了抗体，该抗体的方法是促进的，该抗体的方法是促进的。 Invivo。将UDPGT cDNA整合到带有CMU增强子和鸡β肌动蛋白启动子的表达载体中，然后通过电脉冲将其转移到CHO细胞中，在48小时后，通过薄层色谱法证实了UDPGT的表达。另一方面，为了制备抗体，用N末端15氨基酸的合成肽免疫兔子以获得抗体。我们目前正在寻找该抗体是否识别肝内质网膜蛋白中的UDPGT。我们已经从HVJ-脂质体方法中获得了有关基因转移到Invivo的结果。胰岛素，乙型肝炎病毒蛋白和肾素已在大鼠肝脏中成功表达。为了支持肝细胞中的组织学表达，我们现在使用肝细胞特异性丙酮酸激酶启动子和增强剂成功诱导肝脏表达和胰岛素。体内基因表达的困难在于表达是瞬态的，但是为了克服这一点，我们通过每周重复注射一次成功地实现了约一个月的特定表达。今年，进行了基本实验是出于研究目的，每个人都准备了结果，研究材料，方法等。