ヒト染色体のDNA複製開始点の単離とそれに作用するタンパク質の同定

分离人类染色体的 DNA 复制起点并鉴定作用于其的蛋白质

基本信息

批准号：
03261209
负责人：
釣本敏樹
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

SV40ウイルスDNAの試験管内複製反応系は、ヒト培養細胞の抽出液を使ってDNAの複製活性を直接測定できるという利点を持つ。ここでは、ヒト染色体の複製開始点の単離を目指し、この試験管内反応系を使用して、ヒト染色体上の複製開始点の検索を行なう。まず検索のための複製反応に使用する細胞質抽出液をヒト培養細胞より作り、これを硫安分画、透析、カラムクロマトグラフィ-などにより濃縮した。この濃縮により未知の染色体複製開始因子と共に、DNAポリメレ-ス等、DNA合成に必要なタンパク質が高濃度含まれる粗抽出液が得られることになる。実際にこれらをSV40ウイルスDNAの複製反応に用いたところ、従来の方法より約5倍高い複製活性を有しており、複製タンパク質が高度に濃縮されていることが分かった。次に、ヒト染色体由来のDNAを持つプラスミドライブラリ-を作成した。これは染色体上の複製開始点を検索するのに使用する。ここではヒト第10染色体上、約350キロ塩基対(kb)の領域を担う複数のコスミドを入手し、その制限酵素切断点のマッピングを行なった。現在、このマッピングに基づいて、この領域をさらに約10Kbに断片化したDNAをクロ-ニング中である。このクロ-ニングによって入手できるプラスミドの中には、そのカバ-する領域の大きさから判断して、複数個の複製開始点が含まれるものと考えられる。今後、前述した試験管内複製反応系にこれらプラスミドDNAを加え、そのヌクレオチドの取り込みによって複製活性の検討を行なう。これらの中で高いDNA合成活性を持つプラスミドを複製開始点を持つ候補として選び出し、さらに詳しい解析を行なう予定である。

SV40病毒DNA的体外复制反应系统的优点是，它可以使用培养的人类细胞提取物直接测量DNA的复制活性。在这里，体外反应系统用于搜索人类染色体上复制的起源，以分离人类染色体的复制起源。首先，从人培养的细胞中制备了用于搜索复制反应的细胞质提取物，这是通过硫酸铵分馏，透析，色谱柱色谱等浓缩的。这种富集将导致含有高浓度DNA合成所必需的蛋白质的粗糙提取物，以及诸如DNA Polymeres，以及不合适的CROMOSERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASERASIRATIAN CROMOSASERASIRACTIAN CROMOSASIRATIAN cROMOSASERASERASIANS。实际上，当它们用于SV40病毒DNA的复制反应中时，发现它们的复制活性比常规方法高五倍，并且复制蛋白被高度浓缩。接下来，创建了包含人类染色体DNA的质粒库。这用于搜索染色体上复制的起源。在这里，获得了大约350千碱基对（Kb）的多个宇宙，在人类10上获得了大约350千碱基对（Kb），并映射了限制酶断裂点。目前，基于此映射，将DNA进一步碎片到该区域的大约10 kb。据信，通过这种克隆可用的一些质粒包括由覆盖区域的大小确定的多个复制起源。将来，这些质粒DNA将被添加到上述体外复制反应系统中，并通过掺入核苷酸来研究复制活性。其中，选择具有高DNA合成活性的质粒作为具有复制起源的候选物，并计划进一步详细分析。