ヒト染色体のDNA複製開始点の単離とそれに作用するタンパク質の同定

分离人类染色体的 DNA 复制起点并鉴定作用于其的蛋白质

基本信息

批准号：
03261209
负责人：
釣本敏樹
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

SV40ウイルスDNAの試験管内複製反応系は、ヒト培養細胞の抽出液を使ってDNAの複製活性を直接測定できるという利点を持つ。ここでは、ヒト染色体の複製開始点の単離を目指し、この試験管内反応系を使用して、ヒト染色体上の複製開始点の検索を行なう。まず検索のための複製反応に使用する細胞質抽出液をヒト培養細胞より作り、これを硫安分画、透析、カラムクロマトグラフィ-などにより濃縮した。この濃縮により未知の染色体複製開始因子と共に、DNAポリメレ-ス等、DNA合成に必要なタンパク質が高濃度含まれる粗抽出液が得られることになる。実際にこれらをSV40ウイルスDNAの複製反応に用いたところ、従来の方法より約5倍高い複製活性を有しており、複製タンパク質が高度に濃縮されていることが分かった。次に、ヒト染色体由来のDNAを持つプラスミドライブラリ-を作成した。これは染色体上の複製開始点を検索するのに使用する。ここではヒト第10染色体上、約350キロ塩基対(kb)の領域を担う複数のコスミドを入手し、その制限酵素切断点のマッピングを行なった。現在、このマッピングに基づいて、この領域をさらに約10Kbに断片化したDNAをクロ-ニング中である。このクロ-ニングによって入手できるプラスミドの中には、そのカバ-する領域の大きさから判断して、複数個の複製開始点が含まれるものと考えられる。今後、前述した試験管内複製反応系にこれらプラスミドDNAを加え、そのヌクレオチドの取り込みによって複製活性の検討を行なう。これらの中で高いDNA合成活性を持つプラスミドを複製開始点を持つ候補として選び出し、さらに詳しい解析を行なう予定である。

SV40病毒DNA的体外复制反应系统的优点是可以使用培养的人体细胞的提取物直接测量DNA复制活性。在这里，我们的目标是分离人类染色体上的复制起点，并利用这个体外反应系统来寻找人类染色体上的复制起点。首先，从培养的人体细胞中制备用于搜索复制反应的细胞质提取物，并通过硫酸铵分级、透析、柱层析等进行浓缩。该浓度产生的粗提物含有高浓度的 DNA 合成所需的蛋白质，例如 DNA 聚合酶，以及未知的染色体复制起始因子。当将它们实际用于SV40病毒DNA的复制反应时，发现复制活性比传统方法高约5倍，并且复制蛋白高度浓缩。接下来，他们创建了一个包含源自人类染色体的 DNA 的质粒库。这用于寻找染色体上的复制起点。在这里，我们获得了覆盖人类 10 号染色体上约 350 KB 区域的多个粘粒，并绘制了它们的限制性酶断点。基于此映射，我们目前正在将该区域的 DNA 片段克隆到大约 10 Kb。从覆盖区域的大小来看，通过该克隆获得的质粒被认为包含多个复制起点。将来，我们会将这些质粒DNA添加到上述体外复制反应系统中，并通过掺入核苷酸来检查其复制活性。其中，我们计划选择具有高DNA合成活性的质粒作为复制起点的候选质粒，并进行进一步的详细分析。