ヒト染色体のDNA複製開始点の単離とそれに作用するタンパク質の同定

分离人类染色体的 DNA 复制起点并鉴定作用于其的蛋白质

基本信息

批准号：
04256216
负责人：
釣本敏樹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.試験管内複製反応を使用して、ヒト染色体上の複製開始点の検索を行なった。まず検索の対象としてヒト第10染色体、約350kb領域を選び、約10kbに断片化したプラスミドライブラリーを作成した。このライブラリーDNAを鋳型として、ヒト細胞粗抽出液、あるいはヒト細胞由来の精製された複製タンパク質とSV40ウイルスT抗原を使ってDNA合成開始領域をマップしたところ、挿入されたヒトDNAの特定の複製反応を行なわせたところ、精製した複製タンパク質を使用した反応において、有為に高いDNA合成能を有するクローンを数個得た。これらの部位から合成が開始していることが分かった。今後は高い複製能を持つプラスミドを複製開始点の候補として、複製必須領域の極小化を行ない複製開始に必要なDNA構造の解折を行なう予定である。2.上記の反応では、DNA合成に必要なDNAヘリカーゼ活性はSV40ウイルスT抗原に依存している。従がって染色体の複製反応で使われる細胞由来のDNAヘリカーゼは未同定である。そこで染色複製に関与するDNAヘリカーゼを検索するために、複製に使われるDNAヘリカーゼトDNAポリメラーゼはお互いに相互作用することに着目した。具体的には、抗DNAポリメラーゼα抗体カラムにポリメラーゼと共に結合するタンパク質分画の中からDNAヘリカーゼ活性の探した。この結果、ユニークなDNAヘリカーゼ活性を検出することができた。このDNAヘリカーゼは、DNAポリメラーゼαと相互作用性を持つことが期待され、その特性を解折を行なって、実際に上記の複製開始点の候補プラスミドの複製反応を進めるかどうかを検討している。

1. 利用体外复制反应，我们寻找人类染色体上的复制起点。首先，他们选择人类10号染色体上约350kb的区域作为搜索目标，并创建了片段化为约10kb的质粒文库。以该文库DNA为模板，使用粗制的人细胞提取物或纯化的人细胞来源的复制蛋白与SV40病毒T抗原进行DNA合成起始区域的绘制，进行反应时，获得了几个具有显着高DNA合成能力的克隆。使用纯化的复制蛋白在反应中获得。发现合成是从这些位点开始的。未来，我们计划使用具有高复制能力的质粒作为复制起始位点的候选者，最小化必要的复制区域，并分解复制起始所需的DNA结构。 2.在上述反应中，DNA合成所需的DNA解旋酶活性取决于SV40病毒T抗原。因此，用于染色体复制反应的细胞来源的DNA解旋酶尚未被鉴定。因此，为了寻找参与染料复制的DNA解旋酶，我们关注复制中使用的DNA解旋酶和DNA聚合酶相互作用的事实。具体来说，我们寻找与聚合酶一起结合到抗 DNA 聚合酶 α 抗体柱上的蛋白质级分中的 DNA 解旋酶活性。结果，我们能够检测到独特的 DNA 解旋酶活性。该DNA解旋酶预计会与DNA聚合酶α相互作用，我们正在分析其特性并检查它是否确实促进了上述复制起点候选质粒的复制反应。