分子形態観察に基づく高次機能複合体の解析

基于分子形态观察的高阶功能配合物分析

基本信息

批准号：
12206058
负责人：
釣本敏樹
金额：
--
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

複製、転写等の基本的な細胞機能は、DNAを足場として多数の関連因子が集合体を形成し、その上で特有の反応を進行する。このため、個々の蛋白質分子の機能の理解には、それらが機能複合体を形成する際の分子集合とその動態を理解することが必須である。この目的には蛋白質の1分子レベルの分解能による形態観察が有効と考えられる。そこで、機能複合体として複製フォーク複合体を研究材料とし、そこに含まれる因子の分子形態と機能との連関を明らかにする。この研究を基にして、機能複合体の構成と分子形態を解析する方法論を確立し、蛋白質機能の解明における分子形態情報の有効性を明らかにすることを目的とする。蛋白質の白金蒸着試料の透過式電子顕微鏡(TEM)による観察およびナノカーボンプローブを使用した原子間力顕微鏡(AFM)観察を試み、いずれも蛋白質の分子形態観察に有効であることを明らかにした。たとえば、これらの方法により真核生物の複製フォーク構成因子であるクランプ(PCNA)とそのローダー(RFC)の複合体形成過程の解析を行い、それぞれの因子の分子集合様式、サブユニットの配置が明らかにできた。さらにATP添加による構造変化を観察することができた。さらに両者の複合体像が観察され、形成時の各因子間の位置関係を解明することができた。ここで試みたTEM,AFMによる分子レベルの形態観察は、蛋白質分子の動態、さらにそれらの集合した機能複合体の分子集合を明らかにするのに有効な方法であった。したがって分子形態という情報は蛋白質機能の同定、推定をする上で、有効な要素となりうる。また複合体の集合様式を直接観察することができ、今後研究対象が拡大する高次複合体の解析法として重要性が増加すると思われる。しかし、現在の技術では個々のサブユニット、集合体内のより複雑な位置関係については、解析に限界があり、各構成要素の観察像内での同定法の開発が必要である。この改善によりこれらの方法の有効性はさらに拡大することが期待される。

通过使用DNA作为支架形成众多相关因素，然后经历独特的反应来获得基本的细胞功能，例如复制和转录。因此，要了解单个蛋白质分子的功能，在形成功能复合物时，必须了解分子组装及其动力学。为此，使用单个分子水平蛋白质分辨率的形态学观察被认为是有效的。因此，我们将复制叉复合物作为功能复合物作为研究材料，我们将阐明其中所含因素的分子形态与功能之间的联系。基于这项研究，目的是建立一种分析功能复合物的结构和分子形态的方法，并阐明分子形态信息在阐明蛋白质功能中的有效性。我们试图使用透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）观察铂沉积的蛋白质样品，并使用纳米碳探针进行观察，并揭示两者都有效观察蛋白质的分子形态。例如，这些方法用于分析真核复制叉组成因子夹（PCNA）及其装载机（RFC）的复杂形成过程，并揭示了每个因素的分子组装样式和亚基排列。此外，观察到由于添加ATP而引起的结构变化。此外，观察到了两者的复杂图像，并阐明了形成过程中因子之间的位置关系。使用TEM和AFM尝试的分子水平形态观察是一种有效的方法，可以阐明蛋白质分子的动力学和其组装功能复合物的分子组装。因此，有关分子形态的信息可能是识别和估计蛋白质功能的有效因素。此外，有可能直接观察复合物的形成模式，并且作为高阶复合物的分析方法，它可能会变得越来越重要，这将扩大未来的研究范围。但是，当前的技术在单个亚基和组件内的更复杂的位置关系的分析中存在局限性，并且有必要在每个组件的观察图像中开发识别方法。预计这种改进将进一步扩大这些方法的有效性。