複製因子PCNAと細胞周期調節因子p21の相互作用

复制因子 PCNA 和细胞周期调节因子 p21 之间的相互作用

基本信息

批准号：
07272226
负责人：
釣本敏樹
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07272226/
关键词：
DNA複製細胞周期 PCNA Cipl Wafl

项目摘要

細部増殖制御因子であるp21蛋白質が、細胞内で複製因子PCNAと結合していることが、細胞増殖に対しどのような機能を持つかは、まだ十分理解されていない。そこでp21蛋白質の結合とPCNAの機能の関連を明らかにするため、以下のようにPCNAの変異体を作製し、この蛋白質の機能ドメインとp21結合部位の検索を行った。1.PCNAの複製因子としての機能ドメイン(DNAポリメラーゼ、あるいは複製因子RF-Cとの相互作用部位)を変異を導入したPCNAの機能変化により解析した。その結果、鋳型DNA、DNAポリメラーゼ、さらに複製因子RF-Cと相互作用するドメインがPCNA三量体分子の内側、外側および側面にマップされた。2.野性型および変異を導入したPCNA蛋白質とp21蛋白質の相互作用の程度を、BIAコアシステム、あるい免疫沈降法により測定した。その結果、複製因子としての機能を失った点突然変異を持つPCNAでもすべてp21に結合し、複製因子間の相互作用と異なった結合様式をとること、さらに立体構造に依存した複数の結合部位と相互作用することが示された。3.p21に結合しない出芽酵母のPCNAに着目し、これとヒトPCNAのハイブリッドを作製し、p21との結合性を検討した。その結果、ヒトPCNAのN末端側領域にp21に特異的結合をする構造が存在することが明らかとなった。4.p21によるPCNAの活性への影響を、精製した複製酵素の反応系を使って解析した。その結果、PCNAがDNAポリメラーゼの活性を促進する機能は、PCNA三量体当たり約三分子のp21の結合により効率よく阻害されるのに対し、RF-Cとの相互作用はp21の結合によって影響されなかった。従って、PCNAの関与するDNA複製のDNA鎖伸長過程の中でも、DNAポリメラーゼがPCNAに結合しDNAを合成する過程が直接阻害されていると考えられる。

尚未完全了解p21蛋白（一种细粒生长调节剂）与细胞中复制因子PCNA的结合如何起作用细胞增殖。因此，为了阐明p21蛋白的结合与PCNA的功能之间的关系，制备了PCNA突变体，并搜索该蛋白质的功能结构域和p21结合位点。 1。通过突变引入的PCNA的功能变化分析了PCNA的功能结构域（与DNA聚合酶或复制因子RF-C的相互作用位点。结果，将与模板DNA，DNA聚合酶甚至复制因子RF-C相互作用的结构域映射到PCNA三聚体分子的内部，外部和侧面。 2。通过BIA核心系统或免疫沉淀法测量野生型和突变的PCNA蛋白与P21蛋白之间的相互作用程度。结果表明，即使是具有重复因子与p21结合的点突变的PCNA，也可以从复制因子之间的相互作用中获得不同的结合模式，并与多种依赖构型依赖性结合位点相互作用。 3。专注于不与P21结合的发芽酵母中的PCNA，我们与人PCNA的杂种制成了杂种，并检查了p21的结合特性。结果，揭示了在人PCNA的N末端区域中特异性结合的结构。 4。使用纯化的复制酶反应系统分析了P21对PCNA活性的影响。结果，通过在每个PCNA三聚体的约三个分子的P21结合来有效抑制促进DNA聚合酶活性的PCNA的功能，而与RF-C的相互作用不受p21的结合影响。因此，人们认为，即使在涉及PCNA的DNA复制的DNA链扩展过程中，DNA聚合酶与PCNA结合并合成DNA的过程也直接抑制。