複製フォーク複合体の形成とその制御機構の研究

复制叉复合物的形成及其调控机制研究

• 批准号: 12141203
• 负责人: 釣本 敏樹
• 金额: $ 32.26万
• 依托单位: Kyushu University (2003-2004)Nara Institute of Science and Technology (2000-2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12141203/
• 关键词: WRNヘリカーゼ結合因子; DNAポリメラーゼδ; 染色体接着; クランプローダー; クランプ; ATPase; ユビキチン; DNAポリメラーゼ; チェックポイント; PCNA結合蛋白質; 質量分析; 電子顕微鏡; DNAのメチル化; 再構築; PCNA; DNAメチル化酵素; CDK; サイクリン; p21

1.WRNヘリカーゼ結合因子(WRNIP1)による複製フォーク進行制御ヒトWRNIP1はWRNヘリカーゼに結合するだけでなく、ヒトDNAポリメラーゼδと特異的に相互作用する。この因子の複製活性制御に係わる機能を明らかにするため、ヒトWRNIP1の発現系を構築し精製した。その結果、8量体複合体として振る舞い、DNAにより促進されるATPase活性を有した。またDNAポリメラーゼδの合成開始効率を上昇させることを明らかにした。さらに、この活性促進がATPase活性によって負に調節を受けることから、複製フォーク進行時に、DNA損傷を感知しながらDNA合成活性の制御を行っていることが示唆された。2.複製フォーク進行と染色体接着の連係機構の解析染色体接着に関与するChl12-RFC複合体が複製クランプPCNAの第2のローダーとして機能することを明らかにした。このことはPCNAクランプを介して複製フォークの進行と染色体接着反応が連係していることを意味する。さらに細胞の粗抽出液を使った反応系ではChl12-RFCによるPCNAローディングが見られないことから、細胞内ではPCNAローダーを使い分ける機構があることが考えられた。そこで、細胞抽出液を分画し、その特異性因子を検索し、Chl12-RFCによるPCNAローディングを抑制する因子と共に、Chl12-RFCによって特異的に促進を受けるDNAポリメラーゼ活性を見出した。3.ユビキチン化PCNAの精製と機能解析PCNAのユビキチン化がどのように複製フォーク進行制御に係わっているかを明らかにするため、最低1個のサブユニットが必ずユビキチン化されたPCNAを作成し、その機能変化を解析した。その結果、DNAローディング活性は影響を受けなかったが、PCNAの標的となるDNAポリメラーゼの中に活性が抑えられるものがあることが示された。

1。重复的民间进展控制人WRNIP1用WRN解旋结合因子（WRNIP1）不仅与WRN解旋酶结合，而且还与人DNA聚合酶δ特别相互作用。为了阐明与该因素的重复活性控制有关的功能，构建并纯化了人类WRNIP1表达系统。结果，它充当八个定量复合物，并具有由DNA促进的ATPase活性。它还表明，DNA聚合酶δ的合成起始效率增加。此外，有人提出，由于ATPase活性，对活性的促进进行了负调整，表明在重复的叉子进展过程中，在检测DNA损伤的同时控制了DNA合成活性。 2。涉及副本进展的分析的CHL12-RFC复合物，染色体粘连的机理是重复夹具PCNA的第二个装载机。这意味着副本和染色体粘合剂反应的进展通过PCNA夹连接。此外，由于使用细胞粗提取物的反应系统未显示CHL12-RFC的PCNA负载，因此人们认为存在一种在细胞中使用PCNA负载器的机制。因此，我们发现了一种DNA聚合酶活性，该活性是由CHL12-RFC专门促进的，以及将细胞提取溶液划分的因子搜索其特定因子，并抑制了CHL12-RFC的PCNA负载。 3。为了阐明泛素化的PCNA纯化和功能分析PCNA用于阐明PCNA的泛素化如何参与重复的叉进进度控制，至少有一个子单位用于泛素蛋白的PCNA更改。结果，DNA载荷活性不受影响，但是将某些DNA聚合酶（PCNA的靶标）抑制了。

项目成果

Tadokoro, R. et al.: "Scheduled Conversion of Replication Complex Architecture at Replication Origins of S. cerevisiae during the cell cycle"J Biol Chem.. (In press). (2002)

Tadokoro, R. 等人：“细胞周期期间酿酒酵母复制起点处的复制复合体结构的预定转换”J Biol Chem..（正在出版）。

Tsurimoto,T.: "Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions-Applications of BIACORE (ed.K.Nagata and H.Handa)"DNA polymerase δcomplex.. 10 (2001)

Tsurimoto, T.：“生物分子相互作用的实时分析 - BIACORE 的应用（ed.K.Nagata 和 H.Handa）”DNA 聚合酶 δcomplex.. 10 (2001)

釣本敏樹: "松影昭夫・正井久雄編、「ゲノムの複製とその制御」シュプリンガー・フェアーラーク東京"クランプとクランプローダー. 10 (2002)

Toshiki Tsurimoto：“Akio Matsukage 和 Hisao Masai（编辑），‘基因组复制及其控制’，Springer Verlag Tokyo”Clamps and Clamp Loaders 10 (2002)。

釣本敏樹: "生化学誌特集「DNAポリメラーゼ」:DNAポリメラーゼδ"日本生化学会(In press). (2002)

Toshiki Tsurimoto：“生物化学杂志特稿‘DNA 聚合酶’：DNA 聚合酶 δ”日本生化学会（正在出版）（2002 年）。

Shikata, K. et al.: "The human homologue of fission yeast cdc27, p66, is a component of active human DNA polymerase δ"J. Biochem.. 129. 699-708 (2001)

Shikata, K. 等人：“裂殖酵母 CDC27 的人类同源物，p66，是活性人类 DNA 聚合酶 δ 的一个组成部分” J. Biochem.. 129. 699-708 (2001)