試験管内構築系を用いた真核生物染色体DNA複製初期反応の解析

使用体外构建系统分析真核染色体 DNA 复制的初始反应

基本信息

批准号：
17570142
负责人：
川崎泰生
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17570142/
关键词：
蛋白質核酸遺伝子菌類細胞周期

项目摘要

真核生物の細胞が娘細胞へ染色体を受け渡していくには各染色体上に複数ある複製開始領域(複製オリジン)から厳密に制御された複製開始が起こることが必要であり、この過程に関与するタンパク質因子は酵母からヒトまで保存されていることがわかってきた。複製オリジンのDNA上には多種類のタンパク質あるいはタンパク質サブ複合体が集合・離散する。本研究では真核生物のモデルとして出芽酵母の粗抽出液を用いて新たに展開している試験管内複合体構築系を中心に用いることにより、複製オリジンに段階的に結合するタンパク質サブ複合体を包括的に分離、解析することを行ってきた。まず、既知の複製前複合体の構成因子であるORC、Cdc6、Tah11、Mcm2-7の複製オリジン上での動態の解析を免疫ブロッティングを用いて行い、結合するタイミングがそれぞれ異なることを見いだし、さらにMcm2-7が安定に結合した後、Cdc6やTah11が離れて行くことを見いだした。また、TAP精製法という新規な手法を用いることによりMcm2-7がTah11と安定な複合体として精製できることを見いだした。この複合体は細胞周期を通して見いだされ、この点が酵母と高等真核生物とで異なっているということがわかった。一方、細胞周期G1-S期に起る、Mcm2-7タンパク質のCdc7/Dbf4キナーゼによるリン酸化過程を試験管内で再現することができた。これらの研究を展開して行くことにより、複製オリジンのDNA上に複製前複合体から複製フォークが形成される過程を詳細に解明する道筋ができてきたと考えている。

已经发现，为了使真核细胞将染色体传递给子细胞，必须严格控制的复制起始，每个染色体上的多个复制起始区（复制起源）必须发生，并且该过程中涉及的蛋白质因子从酵母菌中保存到人类。各种类型的蛋白质或蛋白质亚复合物在复制起源的DNA上组装和离散。在这项研究中，我们使用芽酵母的粗提取物作为真核生物的模型，专注于新开发的体外复合物构造系统，并全面分离并分析与阶段复制起源结合的蛋白质亚复合物。首先，我们通过免疫印迹分析了有关复制起源，ORC，ORC，CDC6，TAH11和MCM2-7的已知预复合复合物的动力学，并发现每个人的结合时机在MCM2-7之后均不同。此外，发现MCM2-7可以通过使用一种称为Tap Purification方法的新技术将MCM2-7纯化为使用TAH11的稳定复合物。在整个细胞周期中都发现了这种复合物，发现酵母和更高的真核生物之间的不同。另一方面，在细胞周期的G1-S期间发生的Cdc7/DBF4激酶的MCM2-7蛋白的磷酸化过程被体外复制。通过制定这些研究，我们认为已经创建了一条路径，以详细阐明复制叉从复制起源的DNA上的复制叉形成过程。