試験管内構築系を用いた真核生物染色体DNA複製初期反応の解析

使用体外构建系统分析真核染色体 DNA 复制的初始反应

基本信息

批准号：
17570142
负责人：
川崎泰生
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17570142/
关键词：
蛋白質核酸遺伝子菌類細胞周期

项目摘要

真核生物の細胞が娘細胞へ染色体を受け渡していくには各染色体上に複数ある複製開始領域(複製オリジン)から厳密に制御された複製開始が起こることが必要であり、この過程に関与するタンパク質因子は酵母からヒトまで保存されていることがわかってきた。複製オリジンのDNA上には多種類のタンパク質あるいはタンパク質サブ複合体が集合・離散する。本研究では真核生物のモデルとして出芽酵母の粗抽出液を用いて新たに展開している試験管内複合体構築系を中心に用いることにより、複製オリジンに段階的に結合するタンパク質サブ複合体を包括的に分離、解析することを行ってきた。まず、既知の複製前複合体の構成因子であるORC、Cdc6、Tah11、Mcm2-7の複製オリジン上での動態の解析を免疫ブロッティングを用いて行い、結合するタイミングがそれぞれ異なることを見いだし、さらにMcm2-7が安定に結合した後、Cdc6やTah11が離れて行くことを見いだした。また、TAP精製法という新規な手法を用いることによりMcm2-7がTah11と安定な複合体として精製できることを見いだした。この複合体は細胞周期を通して見いだされ、この点が酵母と高等真核生物とで異なっているということがわかった。一方、細胞周期G1-S期に起る、Mcm2-7タンパク質のCdc7/Dbf4キナーゼによるリン酸化過程を試験管内で再現することができた。これらの研究を展開して行くことにより、複製オリジンのDNA上に複製前複合体から複製フォークが形成される過程を詳細に解明する道筋ができてきたと考えている。

为了使真核细胞将染色体传递给子细胞，必须从每条染色体上的多个复制起始区（复制起点）发生严格控制的复制起始，并且已经发现有许多分子参与该过程，其中蛋白质因子是。从酵母到人类都是保守的。许多类型的蛋白质或蛋白质亚复合物在复制起点的 DNA 上组装和分散。在本研究中，我们将重点关注新开发的以酿酒酵母粗提物作为真核模型的体外复合物构建系统，从而逐步构建与复制起点结合的蛋白质亚复合物，并进行全面的分离和分析。。首先，我们使用免疫印迹分析了复制前复合物的已知成分ORC、Cdc6、Tah11和Mcm2-7在复制起点上的动态，发现它们的结合时间不同。在 Mcm2-7 稳定结合后，Cdc6 和 Tah11 会移走。我们还发现，通过使用称为 TAP 纯化的新技术，可以将 Mcm2-7 纯化为与 Tah11 的稳定复合物。这种复合物存在于整个细胞周期中，并且在酵母和高等真核生物之间存在差异。另一方面，我们能够在体外重现 Cdc7/Dbf4 激酶对 Mcm2-7 蛋白的磷酸化过程，该过程发生在细胞周期的 G1-S 期。通过开展这些研究，我们相信我们已经创建了一条详细阐明复制起点DNA上的复制前复合物形成复制叉的过程的途径。