高等動物ホスホリパーゼA_2の機能、発現、動態の総合評価

高等动物磷脂酶A_2的功能、表达和动态的综合评价

基本信息

批准号：
12480194
负责人：
工藤一郎
金额：
$ 8.9万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

現在までに、哺乳動物からは19種類のボスホリパーゼA2(PLA2)の遺伝子が単離されている。本研究では、分泌性PLA2(sPLA2)群と細胞質PLA2(cPLA2)群に属する酵素について、細胞機能の解析と生体内発現について検討した。1.sPLA2群各種sPLA2とその変異体を導入したHEK293またはRBL-2H3細胞株を用い、アラキドン酸代謝に及ぼす効果を検討し、以下の事実を明らかにした。(1)H型様SPLA2(IIA, IID, IIE, V)は活性化細胞に作用し、刺激依存的にアラキドン酸を遊離する。これらsPLA2は細胞表層のヘパラン硫酸プロテオグリカンであるグリピカンに結合して細胞内に取り込まれ、細胞質内小胞と核膜に蓄積する。(2)X型sPLA2は形質膜外層のボスファアチジルコリン(PC)に作用し、未刺激細胞からアラキドン酸を遊離する。(3)IIF型sPLA2は特徴的なC末端延長配列を介して形質膜に結合し、活性化細胞からアラキドン酸を遊離する。(4)III型sPLA2は分子中央のsPLA2ドメインが活性の細小単位であり、おそらく形質膜表層のPCを認識して未刺激細胞に作用し、アラキドン酸を遊離する。N末とC末に存在する固有のドメインは、本酵素を細胞接着班に集積させる役割を持つ。更に、II型様酵素(IIA, IID, IIE, IIF, V)が炎症時に組織特異的に誘導される酵素であることに着目し、特異抗体を用いてヒト病理組織での発現と分布を調べた。V型sPLA2が虚血心筋、B型肝炎感染肝細胞、肺炎気管支上皮細胞に強く誘導されること、リウマチ関節炎では従来より知られていたIIA型sPLA2だけでなく、IIE, IIF, V型sPLA2も誘導されることが明らかとなった。従来より検討してきたcPLA2αについて、本酵素が細胞活性化に伴って活性を発現する分子機構について更に検討を進めた。その結果、(1)本酵素はC2ドメインを介して細胞骨格蛋白であるビメンチンに結合し、Ca2+依存的に各周縁膜に移行する、(2)本酵素のSer505のMAPキナーゼによるリン酸化に加え、Ser727のMAPキナーゼ活性化キナーゼMNK1によるリン酸化が細胞内での活性化に必須である、ことを明らかにした。更に、(3)本酵素がアポトーシス細胞中でcaspase-3により限定分解されて生じたN末断片が、cPLA2α及び一部のsPLA2によるアラキドン酸遊離をdominant-negative的に抑制することを明らかにした。更に、新たなcPLA2分子種であるcPLA2γについて、以下の結果を得た。(1)本酵素は活性にCa2+を必要とせず、構成的に小胞体膜に結合している。この膜分布には、C末のイソプレニル化が関与している。(2)本酵素発現細胞は構成的にアラキドン酸を遊離し、炎症刺激により更に増強される。本酵素のアラキドン酸遊離能にはC-末のイソプレニル化が必須である。

迄今为止，已从哺乳动物中分离出 19 种类型的纤维脂酶 A2 (PLA2) 基因。在本研究中，我们研究了属于分泌型 PLA2 (sPLA2) 组和细胞质 PLA2 (cPLA2) 组的酶的细胞功能和体内表达。 1. sPLA2组使用导入了各种sPLA2及其突变体的HEK293或RBL-2H3细胞系，我们研究了其对花生四烯酸代谢的影响，并阐明了以下事实。 (1) H 型 SPLA2 (IIA、IID、IIE、V) 作用于活化细胞并以刺激依赖性方式释放花生四烯酸。这些sPLA2与细胞表面的磷脂酰肌醇蛋白聚糖（一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）结合，被摄入细胞内，并在细胞质囊泡和核膜中积累。 (2) X型sPLA2作用于外质膜中的磷脂酰胆碱(PC)，并从未刺激的细胞中释放花生四烯酸。 (3) IIF 型 sPLA2 通过其特有的 C 末端延伸与质膜结合，并从活化的细胞中释放花生四烯酸。 (4)在III型sPLA2中，分子中心的sPLA2结构域是一个小的活性单元，它可能识别质膜表面的PC，作用于未刺激的细胞，释放花生四烯酸。 N 末端和 C 末端的独特结构域在将该酶积累到细胞粘附位点的过程中发挥着重要作用。此外，我们关注II型酶（IIA、IID、IIE、IIF、V）是炎症过程中组织特异性诱导的酶这一事实，并使用特异性抗体研究了它们在人类病理组织中的表达和分布。。 V型sPLA2在缺血心肌、乙型肝炎感染的肝细胞和肺炎支气管上皮细胞中被强烈诱导；在类风湿性关节炎中，不仅IIA型sPLA2，而且IIE型、IIF型和V型sPLA2也被诱导。它被诱导了。对于之前研究过的cPLA2α，我们进一步研究了该酶在细胞活化时表达其活性的分子机制。结果，(1) 该酶通过其 C2 结构域与细胞骨架蛋白波形蛋白结合，并以 Ca2+ 依赖性方式易位到每个外周膜；(2) 除了 MAP 激酶对该酶的 Ser505 进行磷酸化之外，还发现MAP 激酶激活激酶 MNK1 对 Ser727 的磷酸化对于细胞内的激活至关重要。此外，(3)我们发现，凋亡细胞中 caspase-3 对该酶的有限降解产生的 N 末端片段以显性失活方式抑制 cPLA2α 和一些 sPLA2 的花生四烯酸释放。此外，我们还获得了关于新的 cPLA2 分子种类 cPLA2γ 的以下结果。 (1) 该酶的活性不需要 Ca2+，并且与内质网膜组成型结合。 C 末端的异戊二烯化参与了这种膜分布。 (2)表达这种酶的细胞持续释放花生四烯酸，炎症刺激进一步增强花生四烯酸。 C 末端的异戊二烯化对于该酶释放花生四烯酸的能力至关重要。