飼育室排気系ダストを用いた実験動物ウイルスゲノムの新リアルタイム検出法の開発

利用动物房排气系统粉尘开发实验动物病毒基因组实时检测新方法

基本信息

批准号：
15650081
负责人：
佐藤浩
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15650081/
关键词：
ダスト排気エアロゾル PCR ゲノム実験動物飼育室

项目摘要

1.実験動物飼育室排気系統のフィルターダストからのパラインフルエンザ3型ウイルス(PIV3)の検出感度および特異性の検討MHVの遺伝子診断の場合に決めたものと同様に転写量の最も多いと考えられるNタンパク領域をターゲットにして、1st PCR用のKOF1:5'-ATGTCTTTTGTTCCTGGGCAKOR1:GTGATTCTTCCAATTGGCCA2nd PCR用のKOF2:TCATGAAAGTGYTGAATGAGKOR2:CTACTTACATTTCGCTGCACの計4種類のプライマーを設計してRNA-nested PCRを行った。Single-Step AGPC法を用いてフィルターダストから総RNAを調整し、これをテンプレートとしてKOR1をプライマーにリバース反応(37℃、60分間反応)を行い、cDNAを調整した。各cDNAをテンプレートとして1st PCR、さらにこれをテンプレートとして、2nd PCRを行った。2nd PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動して、175bpサイズのバンドが検出された。この診断法は、数分子のcDNAが存在すれば検出可能なきわめて高感度な方法であることが判明した。2.ダスト捕集法の改良実験動物飼育室中の空中飛散ダストをより効率良く捕集する方法と素材について検討した。通常のペーパー製フィルターと東レ製のナイロン素材であるトレミクロン【○!R】(プリフィルター)を比較したところ、1回目の結果では良好なダスト捕集能を示した。しかし、この比較研究については、再現性をさらに検討することとしている。

1.实验动物房排气系统过滤器粉尘中检测副流感3型病毒（PIV3）的敏感性和特异性的检验与MHV基因诊断中测定的结果类似，认为针对 N 蛋白区域的第一次 PCR 的转录量最高。共设计4种PCR引物：KOF2:TCATGAAAGTGYTGAATGAGKOR2:CTACTTACATTTCGCTGCAC，进行RNA巢式PCR。使用Single-Step AGPC法从过滤器灰尘中制备总RNA，并以此为模板，使用KOR1作为引物进行逆反应（37℃反应60分钟）以制备cDNA。以各cDNA为模板进行第一次PCR，以其为模板进行第二次PCR。第二次PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，检测到大小为175 bp的条带。人们发现这种诊断方法是一种极其灵敏的方法，只能检测到少数 cDNA 分子的存在。 2. 集尘方法的改进我们研究了更有效地收集实验动物饲养室空气中灰尘的方法和材料。当比较普通纸质过滤器和东丽制造的尼龙材料 Toray Micron [○!R]（预过滤器）时，第一个结果显示出良好的集尘能力。然而，这项比较研究的可重复性将进一步调查。