系列特異的細胞消去法を応用した免疫細胞の生体内機能解析

使用谱系特异性细胞消除方法对免疫细胞进行体内功能分析

基本信息

批准号：
18659109
负责人：
烏山一
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

系列特異的細胞消去法による免疫細胞の機能解析のシステムを立ち上げるためのモデルスタディとして、これまで機能解析がほとんど進んでいない好塩基球を標的とした好塩基球欠損マウスの樹立を目標に研究を進めた。前年度の研究で、BACクローン上で相同組み換え技術を応用して、好塩基球特異的に発現しているプロテアーゼmMCP-8をコードする遺伝子の蛋白コード領域をジフテリア毒素遺伝子あるいは緑色蛍光色素(GFP)遺伝子に置換したコンストラクトを作製した。本年度は、緑色蛍光色素遺伝子に置換したコンストラクトをマウス受精卵に導入し、BACトランスジェニックマウスの樹立を試みた。生まれてきた子マウスの尾DNAの解析から、低頻度ながら、BAC由来遺伝子が組み込まれた子マウス数匹を得た。それらのマウスの末梢血をフローサイトメトリーで解析したところ、いずれのマウスにおいてもCD49b陽性FcεRI陽性の好塩基球におけるGFPの発現が確認されなかった。そこで、mMCP-8遺伝子を含む別のBACクローンを用いて、GFP置換コンストラクトを作製しなおした。このコンストラクトをin vitroでマウス骨髄細胞に導入したところ、好塩基球特異的にGFPが発現されることが確認された。そこでこのコンストラクトをマウス受精卵に導入したところ、生まれてきた子マウスの一部で、末梢血中の好塩基球におけるGFPの発現が確認された。現在、この好塩基球GFP陽性マウスの子孫を育成中であり、これらのマウスで好塩基球特異的なGFP発現が再度確認されれば、GFPの代わりにジフテリア毒素遺伝子を組み込んだBACコンストラクトを作製して、マウス受精卵に導入する予定である。

作为一项模型研究，旨在建立利用谱系特异性细胞消除对免疫细胞进行功能分析的系统，该研究旨在建立针对嗜碱性粒细胞的嗜碱性粒细胞缺陷小鼠，但迄今为止，该功能分析尚未取得进展。在前一年的研究中，我们在BAC克隆上应用同源重组技术，将编码在嗜碱性粒细胞中特异性表达的蛋白酶mMCP-8的基因的蛋白编码区转化为白喉毒素基因或绿色荧光染料（GFP） ) 基因被替换为构建体。今年，我们尝试通过将绿色荧光染料基因替换到受精小鼠卵中的构建体来建立 BAC 转基因小鼠。通过分析新生小鼠幼崽的尾部DNA，我们获得了几只整合了BAC衍生基因的幼崽，尽管频率较低。当通过流式细胞术分析这些小鼠的外周血时，在任何小鼠的CD49b阳性FcεRI阳性嗜碱性粒细胞中均未确认GFP的表达。因此，我们使用另一个含有 mMCP-8 基因的 BAC 克隆重新生成了 GFP 替换构建体。当将该构建体体外导入小鼠骨髓细胞时，证实GFP在嗜碱性粒细胞中特异性表达。当将该构建体引入小鼠受精卵时，在一些后代外周血的嗜碱性粒细胞中观察到 GFP 表达。我们目前正在培育这些嗜碱性粒细胞 GFP 阳性小鼠的后代，如果在这些小鼠中再次确认嗜碱性粒细胞特异性 GFP 表达，我们将创建一个包含白喉毒素基因而不是 GFP 的 BAC 构建体，计划将其引入。受精的老鼠卵。