セミインタクト細胞系を利用した細胞ストレス応答に関わる翻訳制御機構の解明

使用半完整细胞系阐明细胞应激反应中涉及的翻译控制机制

基本信息

批准号：
16657053
负责人：
村田昌之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では小胞体ストレスや酸化ストレス等の多様な細胞ストレス付加によって翻訳制御を受けている転写因子ATF4の翻訳制御機構を明らかにするため、ストレス依存的に細胞質内にできてくるストレスグラヌルとATF4のmRNAの相互作用について研究を行った。目的のmRNAを生きた細胞内で可視化するためMS2-tag法を利用した。ATF4、アクチン及び膜タンパク質CD4のmRNAの3‘末端にMS2-配列を挿入したプラスミドとGFP-MS2融合タンパク質のプラスミドをCHO細胞に通常の方法で同時にtransfectionした。この時、GFP-MS"タンパク質には核移行シグナルを挿入し、細胞質内でMS2-tag付きmRNAと結合できなかったGFP-MS2は核へ移行し、細胞質内のmRNAが観察しやすいように工夫した。その結果、生きたCHO細胞内において、ATF4、アクチン及びCD4のmRNAの動態を可視化することに成功した。興味深いことに、アクチンmRNAは細胞底面の周縁部のアクチンフィラメントに沿って局在し、ストレス負荷時にもその局在に影響はなかった。ATF4-mRNAは細胞質全体に散在していたが、ストレス負荷によってもその局在に変化はなかった。これに反し、CD4-mRNAは、ストレス負荷により局在を細胞質からストレスグラニュルに大きく変化させた。これらの結果より、ストレス負荷時に翻訳活性化されるATF4は、細胞質に残り、通常翻訳抑制を受けるCD4等のタンパク質はストレスグラニュルにmRNAが集積し翻訳阻害されると予想された。アクチン等ストレス負荷によって翻訳制御を受けないタンパク質も、そのmRNAの局在を変化させない仕組みがあることが判った。このmRNAの可視化システムは、mRNAのストレスグラニュル局在化による翻訳制御メカニズム解明のための基本アッセイ系となることが判った。

在这项研究中，我们调查了应力依赖性方式在细胞质中形成的应力颗粒与ATF4 mRNA之间的相互作用，以阐明ATF4的转化控制机制，ATF4的翻译控制机制是一种转录因子，该转录因子受到各种细胞应激的添加（例如内胞质网状应激和氧化应激）的翻译控制。 MS2-TAG方法用于可视化活细胞中的靶mRNA。在ATF4，肌动蛋白和膜蛋白CD4和GFP-MS2融合蛋白的MRNA的3'末端插入的MS2序列的质粒同时以通常的方式转染了CHO细胞。 At this time, a nuclear translocation signal was inserted into the GFP-MS" protein, and GFP-MS2, which was unable to bind to the MS2-tag mRNA in the cytoplasm, migrating to the nucleus, making it easier to observe mRNA in the cytoplasm. As a result, we successfully visualized the kinetics of ATF4, actin, and CD4 mRNA in living CHO cells. Interestingly, actin mRNA was沿细胞底部的肌动蛋白沿着肌动蛋白的位置，即使在压力载荷期间，其本地化也不会影响ATF4-MRNA。细胞质，通常受到翻译抑制的CD4等蛋白质会在应激颗粒中积累mRNA并抑制翻译。该mRNA可视化系统是一种基本的测定系统，用于通过MRNA的定位来阐明翻译控制机制。

项目成果

期刊论文数量（20）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

セミインタクト細胞アッセイ系の構築

半完整细胞检测系统的构建

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
実験医学 Vol.20(No.16)
影响因子：
0
作者：
Kano;F.;山内忍;村田昌之;Fumi Kano;Fumi Kano;Satomi Nadanaka;加納ふみ
通讯作者：
加納ふみ

EGF signalling amplification induced by dynamic clustering of EGFR

DOI：
10.1016/j.bbrc.2004.09.173
发表时间：
2004-11-19
期刊：
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
影响因子：
3.1
作者：
Ichinose, J;Murata, M;Sako, Y
通讯作者：
Sako, Y

NSF/SNAPs and p97/p47/VCIP135 are sequentially required for cell cycle-dependent reformation of nthe ER network

NSF/SNAP 和 p97/p47/VCIP135 是 ER 网络的细胞周期依赖性重组所必需的

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Genes to Cells 10
影响因子：
0
作者：
Kano;F.
通讯作者：
F.

セミインタクト細胞アッセイ

半完整细胞测定

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
リボソーム応用の新展開人工細胞の開発に向けて(秋吉一成, 辻井薫監修)(NTS出版)
影响因子：
0
作者：
Kano;F.;山内忍;村田昌之
通讯作者：
村田昌之

The maintenance of the ER netwrok is regulated by p47,a cofactor of p97,through phosphorylation by cdc2 kinase

ER 网络的维持由 p47（p97 的辅助因子）通过 cdc2 激酶磷酸化来调节

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Genes to Cells (in press)
影响因子：
0
作者：
Kano;F.;山内忍;村田昌之;Fumi Kano
通讯作者：
Fumi Kano

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通讯作者：
真嶋司，Lee Joon-Hwa，林智彦，西川富美子，鎌足雄司，永田崇，西川諭，桑田一夫，木下正弘，片平正人