ER exit sitesの構造形成・機能発現制御機構の解明

阐明内质网出口位点的结构形成和功能表达控制机制

• 批准号: 18050010
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 4.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18050010/
• 关键词: 小胞体; セミインタクト細胞; オルガネラ; 可視化; ゴルジ体; 小胞輸送; 再構成

ER exit sites(ERES)は、小胞体(ER)からゴルジ体へ向かう輸送小胞の形成プラットフォームである。われわれは先行研究により、膜タンパク質であるYip1AをERESのマーカー膜タンパク質とし、M期におけるERES構造体分解の制御機構を明らかにしている。しかし、本研究実施の過程で、Yip1AはGFP-tag依存的にERESの存在し、多くはゴルジ体に局在化することを発見した。そこで、本研究では、ゴルジ体におけるYip1Aの機能探索を中心に研究を進めた。そのため、小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送(順行輸送と逆行輸送)をゴルジ体に局在化するGT-GFP(ガラクトシルトランスフェラーゼのGFP融合タンパク質)をプローブとしFRAP法を用いてそのキネティックスを含めて定量的に解析する手法を構築した。次に、セミインタクト細胞内で細胞質依存的に生起する小胞体→ゴルジ体間輸送(順行輸送)とゴルジ体→小胞体間輸送(逆行輸送)素過程を分割してアッセイする方法を構築した。次に、Yip1Aの細胞質ドメインのペプチド領域(N末から1-109番目)及び(1-65番目)部分のGST融合タンパク質を調製し、細胞質とともにセミインタクトCHO細胞に加えて順行・逆行輸送アッセイを行った。その結果、興味深いことに、逆行輸送のみがそれらペプチドにより有意に阻害されることが判った。これは、Yip1Aの細胞質側ドメインが細胞質またはゴルジ体表面の輸送装置に作用して、ゴルジ体からのGT-GFPの逆行輸送を競争的に阻害したことを意味する。この他にも、この細胞質ペプチド領域は、VTC/ERGICからのp58の逆行輸送を阻害しなかったこと,RNAi法によりHeLa細胞の内在性のYip1AをノックダウンするとShigatoxinのエンドソーム→ゴルジ体→小胞体の逆行輸送が阻害されることなどから、Yip1Aはゴルジ体からのCOPI依存的な逆行輸送に関わることを示唆する結果を得た(論文投稿中)。

ER出口位点（ERES）是形成从内质网（ER）到高尔基体的传输囊泡的平台。通过先前的研究，我们使用Yip1a（一种膜蛋白）作为ERES的标记膜蛋白，并揭示了在M期控制ERES结构降解的机制。但是，在实施这项研究的过程中，发现Yip1a以GFP-TAG依赖性方式存在，并且大多数将其定位于高尔基体。因此，在这项研究中，我们专注于探索Yip1a在高尔基体中的功能。因此，我们使用GT-GFP（GFP融合蛋白的半乳糖基转移酶）构建了一种定量分析的方法，该方法将囊泡转运（前高尔基体）定位在内质网和高尔基体之间作为探针，并使用FRAP方法在内。接下来，我们构建了一种通过分裂和高尔基间的转运（前向转运）和高尔基间转运（逆行转运）进行测定的方法，这些转运（逆行转运）以细胞质依赖性方式出现在半独立性细胞中。接下来，制备了Yip1a的肽区域（1-109th）和（1-65）中的GST融合蛋白（1-109th）和（1-65th），并且还制备了YIP1A的细胞质结构域，除了半完整的CHO细胞外，还进行了正向和逆行转运测定法以及细胞质。结果很有趣，仅这些肽才能显着抑制逆行运输。这意味着Yip1a的细胞质结构域作用于细胞质或高尔基表面的转运装置，竞争性地抑制了GT-GFP从高尔基体的逆行转运。 In addition, this cytoplasmic peptide region did not inhibit retrograde transport of p58 from VTC/ERGIC, and knockdown of endogenous Yip1A in HeLa cells by RNAi method inhibits retrograde transport of Shigatoxin endosomes → Golgi → Endoplasmic reticulum, resulting in results suggesting that Yip1A is involved in COPI-dependent retrograde transport from the高尔基（纸提交）。

项目成果

ER stress induces ER-Golgi trafficc and surface expression of mutant ABCA1-GFP in HEK293 cells

内质网应激诱导 HEK293 细胞中内质网-高尔基体运输和突变型 ABCA1-GFP 的表面表达

• 发表时间: 2006
• 作者: Toyama R.;Nabeshima Y.;Tsuji Y.;Fujimori T.;Nabeshima Y.;有坂 文雄;Motohiro Nonaka;上田 晴子;Arowu R. Tanaka
• 通讯作者: Arowu R. Tanaka

小胞輸送素過程に関わるキナーゼネットワーク可視化解析システムの構築

囊泡转运元件过程中激酶网络可视化分析系统的构建

• 发表时间: 2007
• 作者: Imura A.;Tsuji Y.;Murata M.;Maeda R. Kubota K.;Iwano A.;Obuse C.;Togashi K.;Tominaga M.;Kita N.;Tomiyama K.;Iijima J.;Nabehsima Y.;Fujioka M.;Asato R.;Tanaka S.;Kojima K.;Ito J.;Nozaki K.;Hashimoto N.;Ito T.;Nishio T.;Uchiyama T.;Fuj;駒田 雅之;島田 貴士;安達淳博
• 通讯作者: 安達淳博

Subcellular localization and physiological significance of intracellular mannan-binding protein

• DOI: 10.1074/jbc.m700992200
• 发表时间: 2007-06-15
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Nonaka, Motohiro;Ma, Bruce Yong;Kawasaki, Toshisuke
• 通讯作者: Kawasaki, Toshisuke

ABCA1の局在を決定する因子の同定

确定 ABCA1 定位的决定因素

• 发表时间: 2007
• 作者: 田中 亜路;その他
• 通讯作者: その他

The physiological significance of intracellular mannan-binding protein

细胞内甘露聚糖结合蛋白的生理意义

• 发表时间: 2006
• 作者: Nonaka M.