セミインタクト細胞を用いたVero毒素の輸送・毒性現機構の可視化解析

使用半完整细胞对 Vero 毒素转运和毒性机制进行可视化分析

基本信息

批准号：
16044209
负责人：
村田昌之
金额：
$ 3.97万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

Vero毒素(O-157毒素)は細胞のエンドサイトーシス経路によって細胞内に取り込まれ、リソソーム経路を回避しながらゴルジ体へと移行し、さらに分泌経路を遡り小胞体(ER)内へ移行する。そして、小胞体内腔から毒素活性のあるAサブユニットが細胞質へ移行することで毒性を発揮する。その輸送経路・制御機構を明らかにすることは毒性発現の予防や疫学的見地から有用であるばかりか、本来、厳格な選別機構で制御されているはずのエンドサイトーシスとエキソサイトーシス経路の曖昧さと両者のクロスロードを制御する分子機構を明らかにできる。本研究では、細胞膜を一部透過性にしたセミインタクト細胞系と細胞内小胞輸送可視化技術を駆使して、哺乳動物細胞における外来細胞毒素(Vero毒素)の細胞内進入機構とその毒性発現制御機構を明らかにすることを目的とした。本年度までに、Vero毒素をリコンビナントタンパク質として大腸菌により大量調製する系を確立した。生細胞内輸送過程を追跡するためCy2標識したを蛍光標識毒素をプローブとして細胞内輸送過程追跡に用いた。その結果、毒素受容体を持つVero生細胞における蛍光標識毒素の細胞内輸送過程(細胞膜→エンドソーム→ゴルジ体→小胞体)を可視化することに成功した。さらに、後期エンドソーム→TGN間の輸送過程をより詳細に検討する目的で、マンノース6リン酸受容体(cation-dependent)のGFP融合タンパク質(GFP-Man6-P受容体)の細胞内動態の可視化と輸送キネティックスの解析法の樹立した。また、セミインタクトVero細胞を用い、蛍光標識毒素及びGFP-Man6-P受容体の細胞内移行過程の可視化再構成し、毒素及びGFP-Man6-P受容体の後期エンドソーム→ゴルジ体(TGN)間輸送過程を細胞質依存的に再構成することができた。

VERO毒素（O-157毒素）通过细胞的内吞途径吸收到细胞中，并在避免溶酶体途径的同时迁移到高尔基体，然后向后返回分泌途径进入内质网（ER）。当毒素活性A亚基从内质网移至细胞质时，毒性会发挥作用。它不仅可以预防毒性发展和流行病学的观点，而且还可以阐明内吞作用和胞吐途径的歧义，最初应通过严格的选择机制来控制，以及调节两者交叉负载的分子机制。这项研究旨在阐明哺乳动物细胞中异源细胞毒素（Vero毒素）细胞内进入的机制，以及通过使用半直的细胞系来控制其毒性表达的机制，该细胞系部分可渗透的细胞膜和细胞内囊泡转运的可视化。到今年，已经建立了一种系统，其中使用大肠杆菌制备Vero毒素作为重组蛋白。 CY2标记以跟踪活细胞运输过程，用于使用荧光标记的毒素作为探针来跟踪细胞内的传输过程。结果，我们成功地看到了带有毒素受体的活细胞中荧光标记的毒素（细胞膜→内体→高尔基体）的细胞内转运过程。此外，为了进一步详细地探索晚期内体和TGN之间的传输过程，我们建立了一种可视化Mannose 6磷酸盐受体（阳离子依赖性）的GFP融合蛋白（GFP-MAN6-P受体）的细胞内动力学（GFP-MAN6-P受体）的方法，并分析传输动力学。此外，半完整的Vero细胞用于视觉上重建荧光标记的毒素和GFP-MAN6-P受体的细胞间迁移过程，以及晚期的内体到GOLGI（TGN）毒素和GFP-MAN6-P受体的转运过程，能够在具有依赖性依赖性依赖性依赖性依赖性的方式中重新构建。

项目成果

期刊论文数量（14）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

EGF signalling amplification induced by dynamic clustering of EGFR

DOI：
10.1016/j.bbrc.2004.09.173
发表时间：
2004-11-19
期刊：
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
影响因子：
3.1
作者：
Ichinose, J;Murata, M;Sako, Y
通讯作者：
Sako, Y

セミインタクト細胞アッセイ系の構築

半完整细胞检测系统的构建

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
実験医学 Vol.20(No.16)
影响因子：
0
作者：
Kano;F.;山内忍;村田昌之;Fumi Kano;Fumi Kano;Satomi Nadanaka;加納ふみ
通讯作者：
加納ふみ

The maintenance of the ER network is regulated by p47, a cofactor of p97, through phosphorylation by cdc2 kinase

ER 网络的维持由 p47（p97 的辅助因子）通过 cdc2 激酶磷酸化来调节

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Genes to Cells 10
影响因子：
0
作者：
Kano;F.
通讯作者：
F.

セミインタクト細胞アッセイ

半完整细胞测定

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
リボソーム応用の新展開人工細胞の開発に向けて(秋吉一成, 辻井薫監修)(NTS出版)
影响因子：
0
作者：
Kano;F.;山内忍;村田昌之
通讯作者：
村田昌之

NSF/SNAPs and p97/p47/VCIP135 are sequentially required for cell cycle-dependent reformation of the ER network

DOI：
10.1111/j.1365-2443.2005.00894.x
发表时间：
2005-10-01
期刊：
GENES TO CELLS
影响因子：
2.1
作者：
Kano, F;Kondo, H;Murata, M
通讯作者：
Murata, M

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DOI：
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0
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通讯作者：
佐甲靖志

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DOI：
发表时间：
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影响因子：
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作者：
山置佑大;永田　崇;清石彩華;三宅雅之;加納ふみ;村田昌之;片平正人;真嶋司，Lee Joon-Hwa，林智彦，西川富美子，鎌足雄司，永田崇，西川諭，桑田一夫，木下正弘，片平正人
通讯作者：
真嶋司，Lee Joon-Hwa，林智彦，西川富美子，鎌足雄司，永田崇，西川諭，桑田一夫，木下正弘，片平正人