細胞極性形成に伴うゴルジ体のトポバイオジェネシスの分子メカニズムの研究

高尔基体拓扑发生与细胞极性形成的分子机制研究

• 批准号: 09878165
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09878165/
• 关键词: ゴルジ体; 細胞内小胞輸送; セミインタクト細胞; GFP; 極性形成; 細胞骨格; 細胞周期; トポバイオジェネシス; 微小管; サミインタクト細胞; 細胞極性形成

セミインタクト極性細胞内で、細胞周期依存的なのゴルジ体の小胞化・リアッセンブリー過程の再構成系を確立した。まず、ゴルジ体局在化シグナルを持つ膜蛋白質とGFPとの融合蛋白質を恒常的に発現しているMDCK細胞株を樹立した。ポリカーボネートトランスウエル上で培養したこのMDCK細胞をストレプトリシンO(SLO)で処理し、形質膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞を作成した。この細胞に、イリマキノン(IQ)を作用させ、ゴルジ体を小胞化させた(IQ依存的小胞化過程)。次に、IQをよく洗い流し、新たに外部よりL5178Y細胞の細胞質とエネルギー再生系(ATP再生系)を加えて小胞化したゴルジ体の核周囲へのリアッセンブリーを再構成した(リアッセンブリー過程)。この再構成系を用い、小胞化過程・リアッセンブリー過程それぞれを2つの素過程にdissectionすることに成功した。次に、それぞれの過程のキネティックスを解析するため「morphometric analysis法」を開発し、中間状態としてゴルジ体が大きめの小胞に分裂し、細胞質中に分散する状態(punctated Golgi membarane)を同定できた、また、それぞれの素過程に必要な因子・阻害剤を検索した結果、ゴルジ体の小胞化前期過程には三量体G蛋白質、リアッセンブリー後期過程にはsmall GTP結合蛋白質の関与を示唆する結果を得た。セミインタクトMDCK細胞に、M期カエル卵抽出液を用いることによってもIQの場合と同様にゴルジ体を小胞化させることに成功した。この過程も、2つの素過程にdissectionできATP再生系を必要とすることが判った。また細胞分裂時に活性化されるキナーゼに対する阻害剤を用いた実験より、過程前期はMAPキナーゼキナーゼ(MEK)が、そして過程後期にはcdc2キナーゼが段階的に効いていることが判った。この再構成系の確立によって、今後、ゴルジ体の細胞周期依存的なグイナミクスの研究とそれぞれの素過程に必要な因子の検索が可能になった。

在半完整的极性细胞中建立了用于细胞周期依赖性高尔基体复制过程的重建系统。首先，我们建立了一个MDCK细胞系，该细胞系组成性地表达具有高尔基体定位信号和GFP的膜蛋白之间的融合蛋白。用链霉菌蛋白O（SLO）处理在聚碳酸酯转孔上培养的MDCK细胞，形成具有部分渗透性质膜的半独立性细胞。将Ilimaquinone（IQ）应用于细胞，使高尔基体被囊泡化（IQ依赖性囊泡形成过程）。接下来，将智商彻底洗净，并新添加了L5178Y细胞的细胞质和能量再生系统（ATP再生系统）从外部重建了高尔基体周围的囊泡riassembly（囊泡过程）。使用此重建系统，我们成功地将囊泡和后组装过程传播到两个基本过程中。接下来，我们开发了一种“形态分析方法”来分析每个过程的动力学，我们能够确定高尔基体将高尔基体分为大囊泡和细胞质中的较大囊泡和分散体的状态。此外，我们搜索了每个基本过程所必需的因素和抑制剂，并获得了结果，表明三聚体G蛋白参与了高尔基体的前剂量前化过程，而小的GTP结合蛋白在晚期的蛋白结合过程中。通过将M相青蛙提取物用于半完整的MDCK细胞，我们能够以与智商相同的方式成功地将高尔基体化为高尔基体。发现此过程还需要一个可以在两个基本过程中传播的ATP再生系统。此外，使用在细胞分裂过程中激活的激酶的抑制剂的实验表明，MAP激酶激酶（MEK）在过程的早期阶段有效，CDC2激酶在过程的阶段有效。这种重建系统的建立使研究高尔基细胞周期依赖性豚鼠并寻找未来每个基本过程所必需的因素成为可能。

项目成果

S.Kagiwada: "The Saccharomyces cerevisiae SCS2 Gene Product,a Homolog of a Synaptobrevin-Associated Protein,Is an Integral Membrane Protein of the Endoplasmic Reticulum and Is required for Inositol Metabolism" The Journal of Bacteriology. 180(in press). (

S.Kagiwada：“酿酒酵母 SCS2 基因产物，突触短蛋白相关蛋白的同源物，是内质网的完整膜蛋白，是肌醇代谢所必需的”《细菌学杂志》。

加納ふみ: "ゴルジ体のバイオジェネシス-極性細胞でのin situ biochemistry & biophysics-" 生物物理. 39巻1号. 29-33 (1999)

Fumi Kano：“高尔基体的生物发生 - 极化细胞中的原位生物化学和生物物理学”，《生物物理学》，第 39 卷，第 1. 29-33 期（1999 年）。

T.Kanaseki: "Structural Features of Membrane Fusion between Influenza Virus and Liposome as Revealed by Quick-Freezing Electron Microscopy," The Journal of Cell Biology. 137. 1041-1056 (1997)

T.Kanaseki：“快速冷冻电子显微镜揭示的流感病毒与脂质体膜融合的结构特征”，《细胞生物学杂志》。

村田昌之: "Caveolin is a cholesterol-binding protein" Proceedings of the Inernational Symposium on Lipoprotein Metabolism and Atherogenesis. (in press). (1999)

Masayuki Murata：“Caveolin 是一种胆固醇结合蛋白”，脂蛋白代谢和动脉粥样硬化国际研讨会论文集（1999 年出版）。

大橋正人: "An arrested late endosome-lysosome intermediate aggregate observed in a Chinese hamster ovary cell mutant isolated by novel three-step screening" Journal of Cell Science. (in press). (1999)

Masato Ohashi：“通过新颖的三步筛选在中国仓鼠卵巢细胞突变体中观察到的晚期内体-溶酶体中间聚集体”（正在出版）。