小胞体ストレスに対する小胞輸送システムによる防御機構の網羅的解析

囊泡运输系统对抗内质网应激防御机制的综合分析

• 批准号: 15032257
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15032257/
• 关键词: 小胞体; ゴルジ体; セミインタクト細胞; GFP; 小胞輸送; メンブレントラフィック; ABCトランスポーター; 可視化

われわれが独自に開発してきた「セミインタクト細胞系」及び「細胞内タンパク質動態可視化技術」を駆使し、小胞体ストレスに応答する細胞内小胞輸送の影響を研究し下記の結果を得た。ABCトランスポーターの一種ABCA1の変異体QRは、従来の活性発現場所である形質膜へは移行せず、小胞体内に蓄積することが知られている。1.QRのGFP融合タンパク質(QR-GFP)を恒常的に発現しているHEK293細胞株(以下、HEK(QR))を構築し、細胞内挙動をタイムラプス装置を持った共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、網目状の典型的な小胞体ネットワークに蓄積していることが判った。2.この細胞に還元剤(DTT)やタプシガルジン(Tg)などよる小胞体ストレスを付加すると、QR-GFPは小胞体から速やかに放出され核近傍のオルガネラに移行した。更にインキュベーションを続けるとQR-GFPのシグナルは形質膜にも観察された。細胞生物学的研究により、小胞体ストレスによってQR-GFPが通常の分泌経路を通り小胞輸送によって形質膜まで運ばれることを確認した。3.通常、小胞体ストレス不可により、小胞体-ゴルジ体間輸送は阻害される(VSVGts045蛋白質の輸送で確認)が、QR-GFPはむしろストレス応答的に開始されるacuteな反応であることが判った。4.この輸送は、{小胞体-ゴルジ体間輸送を阻害するBFAにより阻害されることより、COPI依存的な輸送であることも明らかにした。5.興味深いことに、この輸送は、ARF1ドミナントネガティブ蛋白質(通常の輸送は阻害される)によって活性化されることが判った。6.この輸送経路はセミインタクト細胞系では小胞体ストレスの有無にかかわらず進行した。これらのことより、この小胞輸送は、小胞体の小胞形成過程におけるQR-GFPの小胞内積み込みの為の選別過程での制御によるものであることが明らかになったため、現在、その細胞質因子、小胞体内腔の因子についてその制御に関わる因子を探索中である。

使用我们自己的“半独立细胞系”和“细胞内蛋白质动力学可视化技术”，我们研究了细胞内囊泡转运对内质网应激的影响，并获得了以下结果。众所周知，QR是一种ABCA1的突变QR，一种ABC转运蛋白，不迁移到质膜，质膜是活性表达的常规位点，而是在内质网中积累。 1。我们构建了HEK293细胞系（以下称为HEK（QR）），该细胞系组成表达了QR GFP融合蛋白（QR-GFP），并使用隔段式式网络的网络型网络呈典型的eNtocum eNtopumic，并发现它使用综合激光显微镜观察到细胞内行为。 2。当这些细胞承受网状应激（例如还原剂（DTT）或thapsigardin（TG））时，QR-GFP从内质网迅速释放，并转移到附近的细胞器中。此外，在继续孵育后，在质膜中还观察到QR-GFP信号。细胞生物学研究证实，QR-GFP通过内质网应激引起的囊泡转运通过正常分泌途径将QR-GFP传输到质膜。 3。通常，没有内质网应激会抑制内质网和高尔基体之间的转运（通过VSVGTS045蛋白的运输确认），但发现QR-GFP是一种急性反应，以应力反应方式启动。 4。还揭示了这种运输是一种依赖COPI的运输，因为BFA抑制了它，它抑制了内质网状高尔基传输。 5。有趣的是，发现这种转运被ARF1显性负蛋白（抑制规则转运）激活。 6。该转运途径在具有或没有内质网应激的半独立细胞系中进行。这些发现表明，这种囊泡的传输是由于在内质网的囊泡形成过程中控制了QR-GFP负载浸润过程的分选过程，并且我们目前正在寻找与这些细胞质因子的调节有关的因素，并且在室内肿瘤中的这些因素和因子。

项目成果

村田昌之: "細胞分裂時におけるオルガネラの分配則"実験医学. 21. 2580-2581 (2003)

Masayuki Murata：“细胞分裂过程中细胞器的分布规则”实验医学21。2580-2581（2003）。

Satomi Nadanaka: "Activation of mammalian unfolded protein response is compatible with the quality control system operating in the endoplasmic reticulum"Molecular Biology of the Cell. (In press). (2004)

Satomi Nadanaka：“哺乳动物未折叠蛋白反应的激活与内质网中运行的质量控制系统兼容”《细胞分子生物学》。

Arow, R.Tanaka: "Effects of mutations of ABCA1 in the first extracellular domain on subcellular trafficking and ATP binding/hydrolysis"Journal of Biological Chemistry. 278. 8815-8819 (2003)

Arow, R.Tanaka：“第一个胞外结构域中 ABCA1 突变对亚细胞运输和 ATP 结合/水解的影响”生物化学杂志。

山内忍: "タンパク質の一生の可視化、細胞におけるパク質の一生"蛋白質、核酸、酵素増刊. 印刷中. (2004)

Shinobu Yamauchi：“蛋白质寿命的可视化，细胞中蛋白质的寿命”蛋白质、核酸和酶特刊（2004 年）。