グルタミン酸受容体の構造解析のための新しい精製法の開発-安定多量体ペプチドの応用

谷氨酸受体结构分析新纯化方法的开发——稳定多聚肽的应用

基本信息

批准号：
16657047
负责人：
柚崎通介
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16657047/
关键词：
グルタミン酸受容体構造結晶精製 4量体

项目摘要

哺乳類の中枢神経系の速い神経伝達はグルタミン酸受容体チャネル(GluR)により担われる。更にGluRはシナプス形成や記憶学習、さらには神経細胞死などの多彩な神経機能に関与する。従って、生理的・病的状態におけるシナプス伝達機構を理解するためには、GluRの構造を解明することが非常に重要な課題となっている。しかし膜蛋白質、とりわけGluRのような多量体構造を取る蛋白質の精製は容易ではない。本研究では、GluRのN末端部に、非常に安定した多量体構造を取る人工ペプチドを付加するという新しいアイデアにより、GluRを構造的に安定させて構造解析に適したGluRの精製法を開発することを目的とした。33アミノ酸からなるGCN4ペプチドは、ロイシンジッパー構造を持ち、高温でも非常に安定な4量体を形成することが知られている。また、ロイシンジッパー部位の数ヶ所のアミノ酸を変異させると、今度は非常に安定な2量体、3量体を形成する。そこで、GluRのN末端部にこれらの人工ペプチドを付加し、その構造と機能について検討した。GluR1のN末端部にGCN4ペプチドを導入すると、その多量体構造に応じて、GluR1チャネル複合体におけるGluR1サブユニットの数が正確にコントロールできた。いずれのGluR1変異体も、細胞表面に正常に輸送されるが、4量体型GCN4をN末端部に導入した時にのみ、正常のチャネル機能が観察されることを電気生理学的に確認した。これらのことから、GluR1は4量体構造をとること、N末端側に4量体化ペプチドを導入したGluR1は正常機能を持つことが確認できた(J Biol Chem,2005)。この結果を活かして、GluRの精製法をさらに検討中である。

哺乳动物中枢神经系统中的快速神经传递是由谷氨酸受体通道（GluR）介导的。此外，GluR 还参与多种神经功能，例如突触形成、记忆学习，甚至神经元细胞死亡。因此，阐明GluR的结构对于理解生理和病理条件下的突触传递机制是一个极其重要的问题。然而，纯化膜蛋白并不容易，尤其是具有多聚体结构的蛋白质，例如GluR。在这项研究中，我们利用在GluR的N末端添加形成高度稳定的多聚体结构的人工肽的新思路，开发了一种结构稳定且适合结构分析的GluR纯化方法，目的是GCN4肽由33个氨基酸组成，具有亮氨酸拉链结构，已知即使在高温下也能形成高度稳定的四聚体。此外，当亮氨酸拉链区域的几个氨基酸发生突变时，会形成极其稳定的二聚体和三聚体。因此，我们将这些人工肽添加到GluR的N末端并研究它们的结构和功能。通过将GCN4肽引入GluR1的N末端，可以根据其多聚体结构精确控制GluR1通道复合物中GluR1亚基的数量。尽管所有 GluR1 突变体均正常转运至细胞表面，但我们通过电生理学证实，仅当四聚体 GCN4 引入 N 末端时，才能观察到正常的通道功能。由这些结果证实，GluR1具有四聚体结构，并且N末端引入四聚化肽的GluR1具有正常功能(J Biol Chem，2005)。利用这一结果，我们目前正在研究 GluR 的进一步纯化方法。