膜結合型グルタミン酸受容体結合タンパク質PSD-zip45のX線結晶構造解析

膜结合谷氨酸受体结合蛋白PSD-zip45的X射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
13033042
负责人：
中津亨
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、グルタミン酸受容体(mGluR)に結合するタンパク質であるPSD-Zip45のX線結晶構造解析を行い、情報伝達が行われるときの仕組みを立体構造に基づいて明らかにしようとするものである。PSD-Zip45はC末端領域にロイシンジッパーモチーフが存在し、この部分を用いて自己重合を行うことでmGluRをシナプス後膜に集積させる。シナプス後膜における受容体の集積機構の解明にはC末端領域は非常に重要である。しかし、その一方でこの領域は非常にアグリゲーションを起こしやすいために結晶化を行うための大量調整には困難な点も多い。我々のこれまでの研究で、PSD-zip45ファミリー内で保存されているN末端側186残基中、175残基までの領域についてX線結晶構造解析を行い、PSD-Zip45内の122残基以降の構造をとっていない領域の特定の部分(SPLTP配列)がmGluRへの結合領域であるEVH1ドメインと相互作用していることがわかった。このことからmGluRが存在することで、自己重合を開始する制御機構の存在が示唆された。そこで次に、この領域の水溶液中での挙動を調べるために、X線小角散乱により水溶液中でのこの領域の形状を測定した。その結果、分子の最大長が80Å程度であり分子のRcが9Å程度であることがわかった。この形状は構造をとっていない112残基以降の部分が自由に運動しているときの単量体分子の大きさによく一致した。このことは、結晶格子中で観察されたEVH1ドメインとSPLTP配列の相互作用が水溶液中では起きていないことを示していた。そこで、全体的な構造を明らかにするためにまずPSD-Zip45の全長の精製条件を検討した。その結果、精製バッファーに還元剤として2-メルカプトエタノールを添加することでPSD-Zip45の安定性が向上し、回収量及び精製純度が共に改善された。

本研究的目的是对与谷氨酸受体（mGluR）结合的蛋白质PSD-Zip45进行X射线晶体结构分析，并根据其三维结构阐明信息传输发生的机制。。 PSD-Zip45 在其 C 末端区域具有亮氨酸拉链基序，该区域用于自聚合以在突触后膜中积累 mGluR。 C末端区域对于阐明突触后膜中受体积累的机制非常重要。然而，另一方面，该区域极易发生聚集，因此结晶的质量调整存在很多困难。在我们之前的研究中，我们对 PSD-zip45 家族中保守的 N 端侧 186 个残基中直至第 175 个残基的区域进行了 X 射线晶体结构分析，发现了 PSD-zip45 家族中保守的一个特定部分。非结构化区域（SPLTP 序列）与 EVH1 结构域（即 mGluR 结合区域）相互作用。这表明存在一种由于 mGluR 的存在而引发自聚合的控制机制。接下来，为了研究该区域在水溶液中的行为，我们使用小角X射线散射测量了该区域在水溶液中的形状。结果发现，分子的最大长度约为80 Å，分子的Rc约为9 Å。当残基112之后的非结构化部分自由移动时，该形状与单体分子的尺寸密切对应。这表明在晶格中观察到的EVH1结构域和SPLTP序列之间的相互作用在水溶液中不发生。因此，为了阐明整体结构，我们首先研究了纯化PSD-Zip45全长的条件。结果，通过在纯化缓冲液中添加2-巯基乙醇作为还原剂，PSD-Zip45的稳定性得到提高，回收量和纯化纯度均得到提高。