Gタンパク質共役受容体に対する新規リガンド検索系の開発

开发新的 G 蛋白偶联受体配体搜索系统

• 批准号: 12780579
• 负责人: 武田 茂樹
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Gunma University (2001)The University of Tokyo (2000)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780579/
• 关键词: Gタンパク質共役受容体; リガンド検索; ゲノム; オーファン受容体; リガンドスクリーニング

(1)GPCRに対する効率の良いリガンド検索系の構築我々は受容体とGαの融合タンパク質を昆虫細胞に発現させ、その膜画分を用いて[^<35>S]GTPγSの取込み量を指標に受容体とリガンドとの相互作用を定量的に解析できる活性測定系を確立した。(2)モデル実験によるリガンド検索の可能性の検証実際の生体内リガンド検索のモデルとして、ノシセプチン受容体とGi2αの融合タンパク質を脳内のノシセプチンを検出することを試み、この方法を用いて新規のGPCRに対する生体内リガンドを同定することが可能であることが示した。(3)ヒトゲノム情報を用いたGPCR遺伝子の網羅的検索ヒトゲノム配列情報から新規のGPCR遺伝子を50個同定した。また得られた50個の新規GPCRについてヒトの各種臓器のRNAサンプルを用い、RT-PCR法により発現の有無を調べた。(4)新規受容体遺伝子とGi1, Gs, G16のαサブユニットと融合させた遺伝子の作成得られた新規受容体とGαの融合タンパク質を用いたリガンド検索を行うため、各種Gαとの融合遺伝子を系統的に作成し、融合遺伝子を昆虫細胞や動物細胞で発現させた。(5)新規受容体に対するリガンドのスクリーニング作成した受容体とGαの融合タンパク質を用いて既知物質や脳抽出画分をスクリーニングした結果、これまでにすでに0.1mM-前後で反応するリガンドが11種類、nMレベルで反応するリガンドが1種類得られている。これらの結果は新規受容体に対するスクリーニングが確実に進行していることを示しており、今後は生体内生理活性物質や投与可能な薬剤の同定が期待できる。

（1）为GPCR的有效配体搜索系统的构建，我们建立了一个活性测量系统，该系统使我们能够在昆虫细胞中表达受体Gα融合蛋白，并使用[^<35> s]GTPγs的膜分数定量分析受体与配体之间的相互作用。 （2）通过模型实验验证配体进行搜索的可能性，我们试图通过使用Nociatptin受体和GI2α的融合蛋白作为实际体内配体搜索的模型来检测大脑中的伤害症状，并显示此方法可以用于在体内识别新型GPCRS中的体内。 （3）从人类基因组序列信息中鉴定出使用人类基因组信息五十个新型GPCR基因对GPCR基因的全面搜索。此外，使用的50种新型GPCR用于确定它们是否使用来自各种人体器官的RNA样品使用RT-PCR方法表达。 （4）创建一种将新型受体基因与GI1，GS和G16的α亚基融合的基因，使用获得的新受体和Gα融合蛋白，具有各种Gα的融合基因是系统地创建的，并在昆虫和动物细胞中表达了融合基因。 （5）通过使用产生的受体和Gα的融合蛋白筛选已知物质和脑萃取馏分，对新受体进行筛选，并获得了11种在0.1 mM和一种以NM反应的配体反应的配体类型的配体。这些结果表明，对新受体的筛查正在稳步发展，可以预计将来，体内生理活性物质和可以施用的药物。

项目成果

武田 茂樹, 芳賀 達也: "生物化学実験講座"受容体機能の測定法""東京化学同人. 6 (2001)

武田茂树、芳贺达也：《生物化学实验教程》受体功能的测量方法》《东京化学同人》6(2001)。

Z.-D.Guo et.al.: "Receptor-Gα fusion proteins as a tool for ligand screening"Life Science. (in press).

Z.-D.Guo 等人：“受体-Gα 融合蛋白作为配体筛选的工具”生命科学（正在出版）。

武田茂樹,芳賀達也: "「受容体機能の測定法」生物化学実験講座"東京化学同人(in press).

Shigeki Takeda、Tatsuya Haga：“受体功能的测量”生物化学实验课程，东京化学同人（出版中）。