タバコ煙中低分子化合物による細胞傷害メカニズムの解明と無毒化タバコ作製の試み

阐明烟草烟雾中低分子化合物引起的细胞损伤机制并尝试制造脱毒烟草

• 批准号: 25670123
• 负责人: 三輪 聡一
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25670123/
• 关键词: タバコ煙ガス相; 不飽和カルボニル化合物; アクロレイン; メチルビニルケトン; シクロペンテノン; カルボニル化

我々は、タバコ煙ガス相に含まれる細胞傷害性因子として、不飽和カルボニル化合物であるアクロレイン・メチルビニルケトン・シクロペンテノンの同定に成功した。しかしながら、これらの化合物による細胞傷害の分子機構は不明である。そこで本年度は、不飽和カルボニル化合物による細胞傷害の分子機構の解明に向け、タンパク質のカルボニル化の検出方法の確立を試みた。不飽和カルボニル化合物で処理した細胞から、免疫沈降法によってタンパク質を精製した。精製したタンパク質のカルボニル化の有無を、Aldehyde Reactive Probe（ARP）で検出した。条件検討の結果、免疫沈降にあたっては、細胞の可溶化にNP-40バッファーを用いることで良好な結果が得られることが判明した。この確立した手法を用いてPKC、STIM1、GAPDHなどのタンパク質が不飽和カルボニル化合物によるカルボニル化修飾を受けることを見出した。不飽和カルボニル化合物による細胞傷害を抑制できる化合物を見出すため、ハイスループットかつ定量的な細胞傷害の評価方法の確立を試みた。細胞膜傷害に伴って細胞内に取り込まれるPropidium iodide（PI）の蛍光を、フローサイトメトリーを用いて評価したところ、不飽和カルボニル化合物の濃度、及び処理時間依存的な反応関係が得られた。本手法は、酸化還元反応等、他の化学反応や酵素反応の影響を殆ど受けなかったことから、不飽和カルボニル化合物による細胞傷害の抑制物質のスクリーニングに適した手法であると考えられる。

我们成功地将不饱和羰基化合物丙烯醛，甲基乙烯酮，环戊烯酮鉴定为在烟草烟气相中发现的细胞毒性剂。但是，这些化合物的细胞毒性分子机制尚不清楚。因此，今年，我们试图建立一种检测蛋白羰基化的方法，以阐明由不饱和羰基化合物引起的细胞损伤的分子机制。通过免疫沉淀从不饱和羰基化合物处理的细胞中纯化蛋白质。通过醛反应性探针（ARP）检测到纯化蛋白的羰基化的存在或不存在。由于有条件的研究，发现使用免疫沉淀来溶解细胞时，可以获得良好的结果。使用这种已建立的技术，发现诸如PKC，STIM1和GAPDH之类的蛋白质会使用不饱和羰基化合物进行羰基修饰。为了找到可以抑制由不饱和羰基化合物造成的细胞损伤的化合物，我们试图建立一种评估细胞损伤的高通量，定量方法。使用流式细胞术评估了由于细胞膜损伤而掺入细胞中的碘化丙啶（PI）的荧光，并获得了反应关系，该关系取决于不饱和羰基化合物的浓度和处理时间。该方法被认为是筛选物质的一种合适方法，可抑制由不饱和羰基化合物引起的细胞损伤，因为它几乎不受其他化学物质或酶反应（例如氧化-REDOX反应）的影响。

项目成果

エンドセリン受容体シグナルソーム形成からみた治療戦略

从内皮素受体信号体形成角度考虑的治疗策略

• 发表时间: 2014
• 作者: 石本育栄;都嵜祥人;吉崎幸;安藤史顕;日下敬太;佐塚美幸;飯盛聡一郎;大井克征;桑名仁;油井直史;蘇原映誠;岡戸丈和;野田裕美;頼建光,内田信一;佐々木成.;堀之内孝広，寺田晃士，東恒仁，星暁壮，三輪聡一
• 通讯作者: 堀之内孝広，寺田晃士，東恒仁，星暁壮，三輪聡一

ユビキチン化によるエンドセリン受容体の細胞内トラフィキング制御

通过泛素化调节内皮素受体的细胞内运输

• 发表时间: 2014
• 作者: 三輪聡一;寺田晃士;東恒仁;Nepal Prabha;堀之内孝広
• 通讯作者: 堀之内孝広

Endothelin Receptor Signaling: New Insight Into Its Regulatory Mechanisms

• DOI: 10.1254/jphs.13r02cr
• 发表时间: 2013-10-01
• 期刊: JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES
• 影响因子: 3.5
• 作者: Horinouchi, Takahiro;Terada, Koji;Miwa, Soichi
• 通讯作者: Miwa, Soichi

ラット骨格筋細胞においてエンドセリン-1により活性化されるシグナル伝達機構の解明

阐明大鼠骨骼肌细胞内皮素-1激活的信号转导机制

• 发表时间: 2014
• 作者: Asano;H.;Horinouchi;T.;Mai;Y.;Sawada;O.;Fujii;S.;Nishiya;T.,;星暁壮，堀之内孝広，原田拓弥，比嘉綱己，東恒仁，寺田晃士，眞井洋輔，ネパル・プラハ，堀口美香，旗手千鶴，三輪聡一
• 通讯作者: 星暁壮，堀之内孝広，原田拓弥，比嘉綱己，東恒仁，寺田晃士，眞井洋輔，ネパル・プラハ，堀口美香，旗手千鶴，三輪聡一

Identification of stable cytotoxic factors in the gas phase extract of cigarette smoke and pharmacological characterization of their cytotoxicity.

• DOI: 10.1016/j.tox.2013.08.015
• 发表时间: 2013-12
• 期刊: Toxicology
• 影响因子: 4.5
• 作者: Y. Noya;K. Seki;H. Asano;Y. Mai;T. Horinouchi;T. Higashi;K. Terada;Chizuru Hatate;A. Hoshi;Prabha Nepal;Mika Horiguchi;Y. Kuge;S. Miwa