内皮由来過分極因子の分離・同定・機能解析

内皮源性超极化因子的分离、鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
13024201
负责人：
三輪聡一
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、内皮由来過分極因子(EDHF)およびEDHF反応に関与する関連遺伝子群を、分子生物学的に捕らえようとするものである。我々は、EDHFを同定するために、まずクローン化したKチャネルを用いたEDHFのバイオアッセイ系の確立を試みた。ラット腸間膜動脈において各種Kチャネル阻害薬の作用を検討したところ、EDHF反応に関与するKチャネルとしては、Ca^<2+>-activated K^+ channel(KCa)が想定された。RT-PCRを施行したところ、ラット腸管膜動脈には三種類のKCaが発現していることが確認された。その中の一つであるBK channel遺伝子をHEK細胞に発現させると、脱分極ならびに細胞内カルシウムイオンの上昇に伴い活性化されるK電流が確認された。EDHFの候補として、チトクロームP450代謝産物であるepoxyeicosatrienoic acid(EET)があげられている。そこで、EETのBK channelに対する作用を検討すると、EETはBK channelの電流を増加させ、その作用機序としてはGαsの活性化を介して働くことが確認された。また、ある種の血管ではEDHF反応にギャップジャンクション(GJ)が関与することが報告され、この点について検討した。ラット腸管膜動脈において、EDHF反応はGJを阻害する薬剤でほぼ完全に抑制された。次に、GJを構成するコネキシン(CX)を腸管膜動脈で検討した結果、少なくとも4種類のCX(CX37,40,43,45)が存在することが判明した。免疫組織染色により各CXの分布を検討すると、CX40は内皮細胞に、CX43は内皮と平滑筋細胞に広く分布していた。現在この4分子をクローニングおよび細胞に発現させて、それぞれの分子のEDHF反応に対する役割について検討を重ねている。

这项研究的目的是分子捕获内皮衍生的超极化因子（EDHF）和与EDHF反应有关的相关基因。为了识别EDHF，我们首先尝试使用克隆的K通道建立用于EDHF的生物测定系统。当在大鼠的肠系膜动脉中研究了各种K通道抑制剂的作用时，Ca^<2+>激活的K^+通道（KCA）被假定为参与EDHF响应的K通道。 RT-PCR证实，在大鼠肠动脉中表达了三种类型的KCA。当其中一个基因在HEK细胞中表达时，确认K电流会通过去极化和细胞内钙离子升高而激活。 EDHF的候选者是环氧钠酸（EET），一种细胞色素P450代谢物。因此，当我们检查EET对BK通道的影响时，已经证实EET会增加BK通道的电流，其作用机理是通过激活Gα。还报道了某些血管中的EDHF反应涉及间隙连接（GJ），并检查了这一点。在大鼠肠动脉中，抑制GJ的药物几乎完全抑制了EDHF反应。接下来，我们研究了在肠道中构成GJ的连接蛋白（CX），发现至少四种CX（CX37、40、43、45）。当我们使用免疫组织化学染色检查每个CX的分布时，CX40被广泛分布在内皮细胞中，CX43在内皮和平滑肌细胞中广泛分布。目前，这四个分子在细胞中被克隆和表达，并且正在研究每个分子在EDHF响应中的作用。