バイオプテリン結合活性をもつ新しい機能蛋白質群のcDNAクローニング

具有生物蝶呤结合活性的新功能蛋白组的 cDNA 克隆

基本信息

批准号：
06670106
负责人：
三輪聡一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670106/
关键词：
ビオプテリン結合蛋白質一酸化窒素合成酵素クローニング

项目摘要

我々は第一に,6R-BH_4結合アミノ酸配列のモチーフを既知の6R-BH4結合蛋白質(チロシン及びトリプトファン水酸化酵素や一酸化窒素合成酵素)のアミノ酸配列から予想して,数種類のオリゴヌクレオチドプローブを作成した。ラット脳,培養神経細胞から精製したポリA-RNAをナイロンメンブレンに転写し,これらのプローブを用いてローストリンジェンシーの条件でハイブリダイゼーションを行ったところ,数本の信号が得られた。そこでλgt-10,λgt-11を用いてcDNAライブラリーを作成し,6R-BH_4プローブを用いてプラークハイブリダイゼーションによるλgt-10ライブラリーのスクリーニングを行った。λgt-10ライブラリーから得られたクローンを順次シークエンスしているが,現在までに構造の判明したうちの第一のものは残念ながらBrain-TypeのNitric Oxide Synthase(NOS)と思われた。COS細胞を用いて発現させてみると6R-BH_4,Calmodulin/Ca^<2+>に依存したアルギニンから一酸化窒素(NO)の産成がみられた。しかしながら,NOSとクロスハイブリダイゼーションしたプローブはNOSそのものから取った塩基配列ではない。従って今後新しい塩基配列をコードするクローンが,我々の考案した6R-BH_4プローブによって分離される可能性が高いと思われる。現在もクローニング及びシークエンシングを続行中である。λgt-11ライブラリーについては,これを大腸菌に感染させた後ナイロンメンブレンに発現蛋白質を吸着させ,この蛋白質とトリチウムラベルした6R-BH_4との結合性をオートラジオグラムで検討する事によってスクリーニングを行った。しかしながら,トリチウムラベルは効率がおもわしくなく,また[^3H]6R-BH_4の精製回収にも多大な時間が必要とされるため実験回数に制限がかっており,今のところ有力なクローンは得られていない。

我们首先预测了已知的6R-BH4结合蛋白（酪氨酸和色氨酸羟化酶和一氧化物氧化物同酶）的氨基酸序列的6R-BH_4结合氨基酸序列的基序，并产生了几种寡核苷酸探针。从大鼠脑和培养的神经元中纯化的多蛋白-RNA转移到尼龙膜上，并在卵裂条件下使用这些探针进行杂交，从而产生多个信号。因此，使用λGT-10和λGT-11创建cDNA库，并使用6R-BH_4探针通过斑块杂交对λGT-10库进行筛选。从λGT-10文库获得的克隆是顺序测序的，不幸的是，迄今为止发现的第一个结构是脑型一氧化氮合酶（NOS）。当使用COS细胞表达时，观察到基于6R-BH_4，钙调蛋白/Ca^<2+>的精氨酸的一氧化氮（NO）产生。但是，与NOS交叉杂交的探针不是从NOS本身获取的核苷酸序列。因此，将来，编码新基础序列的克隆可能会被我们设计的6R-BH_4探针分开。克隆和测序仍在继续。通过感染大肠杆菌并将表达蛋白吸附到尼龙膜上的λGT-11文库进行筛选，并通过自变量图检查了该蛋白与Tritium标记的6R-BH_4的结合特性。但是，tri木标签不高，并且[^3H] 6R-BH_4的纯化和恢复需要很大的时间，因此实验的数量受到限制，到目前为止尚未获得有希望的克隆。