再構成系を用いたアミロイド伝播の統合的理解

使用重建系统对淀粉样蛋白传播的综合理解

基本信息

批准号：
20H00501
负责人：
田中元雅
金额：
$ 28.7万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、独自の酵母プリオンSup35および神経変性疾患原因タンパク質の実験系と全反射照明顕微鏡やクライオ電子顕微鏡、核磁気共鳴法(NMR)などの生物物理学的手法からアミロイドの生成および脱凝集過程を統合的に理解することを目指した。本年度は、NMRで同定したSup35NMタンパク質内の各シャペロンの結合部位を利用した実験を進めた。これまでの研究でシャペロン結合部位がコア構造に入り込んでいるためシャペロン群によって認識されずに脱凝集されにくいことが示唆されている変異体アミロイドを脱凝集させることに成功した。また、プロテアーゼ含有ハイブリッド型の酵素を用いて、その変異体アミロイドを選択的に分解させることができた。特に、新たに付加させたシャペロン結合部位が露出しているために変異体アミロイドに対してシャペロン結合が実際に促進することで、脱凝集や分解の効率が著しく増大したことを、蛍光色素を用いたアッセイや全反射照明蛍光顕微鏡を用いたタイムラプスのイメージング実験から明らかにした。さらに、神経変性疾患の病態解明を目指し、様々な構造をもつアミロイドを作成する手法を確立させた。クライオ電子顕微鏡を含む生物物理学的手法による精密測定からその構造が患者脳由来のアミロイド線維構造と同一であることを見い出した。また、各種アミロイド多型を作成し、そのアミロイドを異なるセットの複数のシャペロン群を用いた実験を行ったところ、脱凝集されることが示唆された。

在这项研究中，我们使用酵母朊病毒Sup35和神经退行性疾病致病蛋白的独特实验系统以及全内反射照明显微镜、冷冻电子显微镜和核磁共振等生物物理方法研究了淀粉样蛋白的产生和分解过程。我们旨在以综合的方式理解这一点。今年，我们利用 NMR 鉴定的 Sup35NM 蛋白中每个伴侣的结合位点进行了实验。他们成功地分解了突变淀粉样蛋白，之前的研究表明这种淀粉样蛋白很难分解，因为伴侣结合位点嵌入核心结构中并且不被伴侣基团识别。此外，他们能够使用含有蛋白酶的杂合酶选择性降解突变淀粉样蛋白。特别是，我们使用荧光染料证明新添加的伴侣结合位点被暴露，这实际上促进了伴侣与突变淀粉样蛋白的结合，导致解聚和分解效率显着增加，这是通过测定和延时成像揭示的。使用 TIRF 照明荧光显微镜进行实验。此外，为了阐明神经退行性疾病的病理学，我们建立了一种产生具有各种结构的淀粉样蛋白的方法。使用冷冻电子显微镜等生物物理技术进行的精确测量表明，其结构与来自患者大脑的淀粉样原纤维的结构相同。此外，当创建各种淀粉样蛋白多态性并使用不同组的多个伴侣组进行实验时，表明淀粉样蛋白可以被分解。