一分子力学計測による酵母プリオンのコンフォメーション空間解析

使用单分子动力学测量对酵母朊病毒进行构象空间分析

基本信息

批准号：
13F03510
负责人：
田中元雅
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質のモノマー状態での構造の不均一性・多様性は、その物性や機能に大きな影響を与える可能性がある。しかし、タンパク質がモノマー状態の構造として取り得る構造の幅広さ、つまりコンフォメーション空間を実験的に明らかにすることは既存の技術では難しい。本研究では、線維状のタンパク質凝集体であるアミロイド構造とプリオン株表現型の解析をこれまで我々が進めてきた酵母プリオンSup35NMの系を用いて、一分子力学計測によりSup35NMモノマーのコンフォメーション空間を解明することを目指す。特に各種シャペロンがSup35NMのコンフォメーション空間、さらにはSup35NMの凝集化に与える影響を詳しく解析するためには、活性のあるシャペロンを調製する必要がある。そこで、本年度は、大腸菌から発現させたHsp104の精製を行い、それがほぼ完全に6量体を形成すること、Sup35NMの凝集促進活性やGFPやルシフェラーゼ凝集体に対するリフォールディング活性を確認した。また、各種Hsp104変異体の精製も行い、純度の高い変異体も得られた。そこで、Sup35NMアミロイドの脱凝集化について検討を行ったところ、Hsp104のATPase活性が、脱凝集化の際のモノマー化の過程に深く関わることが示唆された。一方で、Sup35NMモノマーのオリゴマー化に対して、Hsp104が他のシャペロン群と協調して働くことが明らかになった。

蛋白质单体状态的结构异质性和多样性对其物理性质和功能产生重大影响。然而，使用现有技术很难通过实验阐明蛋白质在单体状态下可以具有的广泛结构，即构象空间。在这项研究中，我们使用我们一直在研究的酵母朊病毒Sup35NM系统来分析淀粉样蛋白（一种纤维状蛋白聚集体）的结构，以及朊病毒菌株的表型，我们的目的是阐明这一点。特别是，为了详细分析各种伴侣对Sup35NM构象空间以及对Sup35NM聚集的影响，有必要制备活性伴侣。因此，今年，我们纯化了从大肠杆菌中表达的Hsp104，并确认其几乎完全形成六聚体，并且具有Sup35NM的聚集促进活性以及针对GFP和荧光素酶聚集体的重折叠活性。我们还纯化了多种Hsp104突变体，获得了高纯度的突变体。因此，当我们研究Sup35NM淀粉样蛋白的解聚时，表明Hsp104的ATP酶活性深入参与了解聚过程中的单体化过程。另一方面，研究表明Hsp104与其他分子伴侣合作寡聚Sup35NM单体。