抗L型電位依存性カルシウムチャネル抗体測定系の確立 -自己免疫性神経・内分泌疾患における抗カルシウムチャネル抗体の意義-

抗L型电压门控钙通道抗体测定体系的建立 - 抗钙通道抗体在自身免疫性神经及内分泌疾病中的意义 -

基本信息

批准号：
08877156
负责人：
千原和夫
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.神経・内分泌細胞型α1およびβサブユニット-Glutathione S-transferase(GST)融合蛋白の産生既知の完全長の神経・内分泌細胞型α1サブユニットcDNAをpGEXに組み込み、α1サブユニットとGST蛋白の融合蛋白を発現するベクターを作製し、大腸菌DH5αをトランスフォームしたが、融合蛋白の発現を認めなかった。これは、α1サブユニットのcDNAが6Kbp以上と長大であること、膜貫通構造をとっており、疎水性が大であることによると考えられた。そこで、α1サブユニットのcDNAを数百から1Kbp程度のセグメントに分割し、GST融合蛋白質発現ベクターに組み込み融合蛋白の発現を試みた。さらに、カルシウムチャネルのβサブユニット(カルシウムチャネルの機能発現に重要なサブユニットであり、重症筋無力症ではβ1サブユニットに対する自己抗体が検出されるという報告がある)のβ1、β2、β3cDNA(約1.5-1.8Kbp)についてもGST融合蛋白質発現ベクターを作製した。α1サブユニットに関しては、十分量の蛋白産性が得られていないが、βサブユニットについては、発現が良好でGlutathione-Sepharoseアフィニティーカラムを用いて精製後、SDS電気泳動で確認した結果、目的とする蛋白が得られたことを確認した。現在、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィーを併用して、さらなる精製度の向上と収量の増大をめざしている。2.抗VDCCα1サブユニット抗体測定ELISA系の確立上記の精製α1、βサブユニット蛋白が、まだ十分量得られていないため、ELISA系の確立はできていない。しかしながら、確立後直ちに測定に移れるよう、polyglandular autoimmune syndrome(PGS)、ACTH単独欠損症、IDDMやALS等の自己免疫的機序が発症に関与する可能性がある疾患の患者血清を採取、保存しつつある。

1.神经/内分泌细胞型α1和β亚基-谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白的制作将已知的全长神经/内分泌细胞型α1亚基cDNA整合到pGEX中，合成α1亚基和GST蛋白创建表达融合蛋白的载体并转化大肠杆菌DH5α，但没有观察到融合蛋白的表达。这被认为是由于α1亚基的cDNA很长，超过6Kbp，具有跨膜结构，并且具有高度疏水性。因此，我们尝试将α1亚基cDNA分成数百至1Kbp的片段，并将其插入GST融合蛋白表达载体中来表达融合蛋白。此外，我们还构建了β1、β2和β3 cDNA（约1.5-1.8Kbp）GST融合蛋白表达载体。对于α1亚基，尚未获得足够的蛋白质生产率，但对于β亚基，表达良好，并且使用谷胱甘肽-琼脂糖亲和柱进行纯化并通过SDS电泳进行确认，结果证实目标蛋白质证实获得了所需的蛋白质。目前，我们的目标是通过硫酸铵沉淀和离子交换层析的结合，进一步提高纯化程度，提高收率。 2.测定抗VDCCα1亚基抗体的ELISA系统的建立由于尚未获得足够数量的上述纯化的α1和β亚基蛋白，因此尚未建立ELISA系统。然而，为了能够在建立后立即进行测量，收集了患有可能与自身免疫机制相关的疾病的患者的血清样本，例如多腺体自身免疫综合征（PGS）、孤立性ACTH缺乏症、IDDM和ALS并存储起来。