植物の微小管付随タンパク質の制御機構

植物微管相关蛋白的调控机制

基本信息

批准号：
05F05451
负责人：
橋本隆
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

微小管の様々な構造や機能は微小管に結合する多くの微小管付随タンパク質(microtubule-associated proteins ; MAPs)により制御されている。動物細胞や酵母を用いた研究により、MAPSは機能分化した複合体を形成するとともに、それぞれのMAPは主にリン酸化により微小管結合活性などが調節されている。本研究では、微小管機能を制御するフォスファターゼについて、それらの機能と生体内の基質を調べる実験を行った。MAP kinase phosphatase PHS1のdominant negative変異株phsl-1の微小管変異表現型を相補するPHS1内のサブレッサー変異を遺伝学的に複数同定している。これらのサプレッサー変異をもつPHS1が通常のフォスファターゼ活性を持つかどうか調べるために、数種類の変異型組換えタンパク質を大腸菌で発現させた。組換えPHSlは不溶性になり易いため、融合するタグ蛋白質の種類を検討した。微小管の安定性に影響を与える3つのフォスファターゼと関連タンパク質(PHS1,TON1,TON2)を遺伝子発現誘導系により、アラビドブシス植物体で強制発現又は発現抑制を試みる。しかし、形質転換植物体ではこれらのフォスファターゼはほとんど発現しなかった。phs1-1変異株の根端部位においてリン酸化状態が野生型と異なるタンパク質をリン酸化蛋白質の濃縮後、二次元電気泳動により調べ、一部の候補蛋白質をMS分析により同定した。

微管的各种结构和功能由许多与微管结合的微管相关蛋白（MAP）控制。使用动物细胞和酵母的研究表明，MAPS 形成功能分化的复合物，并且每个 MAP 的微管结合活性主要通过磷酸化来调节。在这项研究中，我们进行了实验来研究控制微管功能的磷酸酶的功能和体内底物。我们通过基因鉴定发现了 MAP 激酶磷酸酶 PHS1 中的多个亚突变，这些突变补充了显性失活突变株 phsl-1 的微管突变表型。为了研究带有这些抑制突变的 PHS1 是否具有正常的磷酸酶活性，在大肠杆菌中表达了几种类型的突变重组蛋白。由于重组PHS1往往是不溶的，我们研究了要融合的标签蛋白的类型。我们将尝试使用基因表达诱导系统强制表达或抑制影响拟南芥植物微管稳定性的三种磷酸酶和相关蛋白（PHS1、TON1、TON2）的表达。然而，这些磷酸酶在转化植物中几乎不表达。浓缩磷酸化蛋白后，我们通过二维电泳研究了phs1-1突变体根尖中磷酸化状态与野生型不同的蛋白，并通过MS分析鉴定了一些候选蛋白。