クロ-ン化デスモグラキンcDNAの解析と生物学的応用の検討

克隆桥粒光蛋白 cDNA 的分析和生物学应用的考虑

基本信息

批准号：
01570575
负责人：
橋本隆
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

私どもの作成したモノクロ-ナル抗体(MAb)は、当初、デスモゾ-ム構成蛋白desmoplakin I、II(それぞれ分子量約250kD、210kD)と反応すると考えられた。しかし、さらに詳細な免疫ブロット法検索の結果、約700kDの巨大分子と反応することが判明し、immunogold免疫電顕によりデスモゾ-ムに特異的に反応することが示され、このMAbは全く新しいデスモゾ-ム構成蛋白を認識することが明らかとなった。私どもは、この蛋白を多量に産生するマウス表皮細胞Pam cellよりmRNAを抽出し、cDNAを合成し、λZAP II発現ベクタ-を用いてcDNAライブラリ-を作成した。このMAbによりcDNAライブラリ-を免疫スクリ-ニングし9個の陽性クロ-ンを得た。これらのファ-ジベクタ-より制限酵素ないしヘルパ-ファ-ジによりインサ-トを切出しプラズミドpBluescriptにサブクロ-ニングした。これらのインサ-トは2-4kbの比較的大きなものであった。IPTGにより発現させたリコンビナント蛋白を免疫ブロット法により解析し、すべてのリコンビナント蛋白がこのMAbと特異的に反応することを確認した。制限酵素地図を作成し、M13ジデオキシ法(Sanger法)により部分的塩基配列を決定した。さらに、Pam cellより抽出したmRNAを用いたノ-ザンブロット解析により、これらのcDNAは約15kbと13kbの二つのメッセ-ジとハイブリダイズすることが示された。これらの結果は、私どもの得たクロ-ンが全く新しい蛋白をコ-ドしていることを裏付けるものであった。今後、これらのクロ-ンを用いてcDNAライブラリ-を再スクリ-ニングすることにより、この蛋白の全cDNAをクロ-ニングしたい。これにより、この蛋白の構造および他のデスモゾ-ム構成蛋白、およびケラチンとの関連が明らかになることは、細胞接着機構の研究に大きな進歩をもたらすものと考える。

我们创建的单克隆抗体 (MAb) 最初被认为与桥粒组成蛋白桥粒斑蛋白 I 和 II（分子量分别约为 250kD 和 210kD）发生反应。然而，通过更详细的免疫印迹搜索，发现它与大约700kD的大分子发生反应，并且免疫金免疫电子显微镜显示它与桥粒发生特异性反应，使得这种MAb成为一种全新的桥粒被揭示。该蛋白质识别-me成分蛋白质。我们从 Pam 细胞（产生大量这种蛋白质的小鼠表皮细胞）中提取 mRNA，合成 cDNA，并使用 λZAP II 表达载体创建 cDNA 文库。使用该MAb对cDNA文库进行免疫筛选，获得9个阳性克隆。使用限制酶或辅助噬菌体从这些噬菌体载体中切下插入片段，并亚克隆到质粒 pBluescript 中。这些插入片段相对较大，为 2-4kb。通过免疫印迹分析IPTG表达的重组蛋白，并证实所有重组蛋白均与该MAb发生特异性反应。使用M13双脱氧法（桑格法）制作限制酶图谱并确定部分碱基序列。此外，使用从 Pam 细胞提取的 mRNA 进行的 Northern 印迹分析表明，这些 cDNA 与大约 15kb 和 13kb 的两条信息杂交。这些结果证实我们获得的克隆编码一种全新的蛋白质。将来，我们希望通过使用这些克隆重新筛选 cDNA 文库来克隆该蛋白质的完整 cDNA。我们相信，该蛋白结构的阐明及其与其他桥粒构成蛋白和角蛋白的关系将为细胞粘附机制的研究带来巨大进展。