表皮細胞における脂質のATP結合トランスポーターABCA12の構造機能相関の解析

表皮细胞脂质ATP结合转运蛋白ABCA12的结构与功能关系分析

基本信息

批准号：
21659263
负责人：
秋山真志
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659263/
关键词：
ABCA 脂質輸送層板顆粒 trafficking 基質特異性

项目摘要

本研究の目的は、表皮ケラチノサイトの脂質輸送タンパク、ABCA12の細胞内局在の解明、ABCA12の輸送する脂質についての基質特異性の検討、表皮の脂質分泌顆粒(層板顆粒)のtraffickingにおけるABCA12の役割の解析である。これらの解析のデータから、皮膚のバリア形成のキー・トランスポーターであるABCA12の構造機能相関の情報が得られるだけでなく、表皮ケラチノサイトの脂質輸送機構のダイナミックな理解、脂質分泌顆粒である層板顆粒のtraffficking機構の解明につながる。具体的には、以下の3点の研究を施行した。(1)ABCA12の細胞内局在の解明正常ヒト皮膚ケラチノサイト、道化師様魚鱗癬病変部皮膚ケラチノサイトにおけるABCA12の発現、局在を、免疫組織学的に検討した。さらに、リポーター遺伝子を組み込んだ各種ABCA12コンストラクトを作成し、正常ヒト皮膚ケラチノサイト、道化師様魚鱗癬病変部皮膚ケラチノサイト、CHO細胞に導入し、ABCA12の発現、局在を検討した。(2)ABCA12の輸送する脂質の基質特異性の解明正常ヒト皮膚ケラチノサイト、道化師様魚鱗癬病変部皮膚ケラチノサイトを培養し、培養細胞中のgranular compartment、cytosolic compartmentの脂質の成分分析を行った。さらに、CHO細胞に正常ABCA12を含むコンストラクトを導入し、ABCA12タンパクを強制発現させ、培養細胞中のgranular compartment、cytosolic compartmentの脂質の成分分析を行った。ラベルしたセラミド、コレステロール、遊離脂肪酸を、各種培養細胞に取り込ませ、脂質輸送の過程を解析した。(3)ABCA12の脂質輸送・分泌顆粒(層版顆粒)のtraffickingにおける役割の解明正常ヒト皮膚ケラチノサイト、道化師様魚鱗癬病変部皮膚ケラチノサイト、各種ABCA12コンストラクトを導入したCHO細胞において、各種trafficking関連タンパクの発現、分布を解析した。さらに、ABCA12ノックアウト・マウス由来のケラチノサイトに、各種trafficking関連タンパクの発現、分布を解析した。

这项研究的目的是阐明ABCA12在表皮角质形成细胞中的亚细胞定位，检查ABCA12运输的脂质的底物特异性，并分析ABCA12在脂质分泌的花岗岩（pratted虫）中的贩运中的作用。这些分析数据提供了有关ABCA12的结构和功能相关性的信息，ABCA12是皮肤屏障形成的关键转运蛋白，以及对表皮角膜素细胞的脂质转运机制的动态理解以及脂质分泌Granuules脂质机制的运输机制的阐明。具体而言，进行了以下三项研究。（1）阐明ABCA12亚细胞定位在正常的人皮肤角质形成细胞中的表达和定位，并在类似小丑样的鱼质病损伤中的皮肤角质形成细胞和皮肤角质形成细胞进行了免疫组织化学检查。此外，创建了包含报告基因的各种ABCA12构建体并引入正常的人类皮肤角质形成细胞，小丑样的鱼质病皮肤角质形成细胞和CHO细胞，以研究ABCA12的表达和定位。（2）阐明ABCA12运输的脂质的底物特异性。培养了正常的人类皮肤角质形成细胞和皮肤角质形成细胞，培养了类似小丑样的鱼质病的病变，并分析了培养细胞中颗粒状和胞质隔室的脂质成分。此外，将含有正常ABCA12的构建体引入CHO细胞中，并强迫ABCA12蛋白表达，并在培养的细胞中分析了颗粒状和胞质室的脂质成分。将标记的神经酰胺，胆固醇和游离脂肪酸掺入各种培养细胞中，以分析脂质转运过程。（3）阐明ABCA12在脂质转运和分泌颗粒（分层颗粒）运输中的作用（分层颗粒）在正常的人类皮肤角质细胞中分析了各种与运输相关的蛋白质的表达和分布。此外，分析了从ABCA12基因敲除小鼠衍生的角质形成细胞上分析了各种运输相关蛋白的表达和分布。