インビトロ血液脳関門システムによる分子・細胞動態リアルタイムイメージング法の開発

利用体外血脑屏障系统开发分子和细胞动力学实时成像方法

基本信息

批准号：
21659016
负责人：
南雅文
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

骨髄間葉系幹細胞(MSC)の静脈内投与は、脳梗塞後の神経機能障害を改善する。昨年度は、マクロファージやミクログリアの脳微小血管内皮細胞(BMEC)層の通過機構に関して検討を行ってきたが、今年度は、臨床応用が期待されているMSCの血液脳関門(BBB)通過機構の解析を行った。はじめに、MSCのBBB通過機構の解析に用いるインビトロ評価系を、BMECからなるインビトロBBBモデルとMSCを組み合わせることで構築した。BMECは全ての細胞が緑色蛍光を発するSD-Tg(CAG-EGFP)ラットから採取して培養したものを、MSCはラット骨髄から採取して培養し、蛍光試薬PKH26で標識したものをそれぞれ用いた。細胞培養インサート(メンブレンのポアサイズは8.0μm)にBMECを播種し、インサートのlowerチャンバーに10%牛胎仔血清を加えた条件下、upperチャンバーにMSC(1.5×10^4cells/cm^2)を加え、24時間後に固定して観察した。BMECの形態や単層構造に顕著な変化は認められない一方で、BMEC層を通過し、BMEC下にてメンブレン上に接着したMSCが多数観察された。また、ポアを通過してメンブレンの裏側に接着したMSCも認められた。MSCがどのようにBMEC層を通過するのかを明らかにするために、タイムラプスイメージングにより両細胞の動態を観察した。その結果、MSCが傍細胞経路を介してBMEC層を通過する様子が観察された。また、MSCがBMEC層を通過する際には、一時的にBMEC間隙が拡がり、通過後、その間隙は閉じて元の状態に戻る様子も観察された。以上より、本研究においてMSCのBMEC層通過を評価・観察できるインビトロ実験系の構築に成功し、この実験系を用いて、MSCが傍細胞経路でBMEC層を通過することを明らかにした。

静脉注射骨髓间充质干细胞（MSC）可改善脑梗塞后的神经功能障碍。去年我们研究了巨噬细胞和小胶质细胞穿过脑微血管内皮细胞（BMEC）层的机制，今年我们将分析MSC穿过血脑屏障（BBB）的机制，预计我做到了临床应用。首先，将MSC与BMEC组成的体外BBB模型相结合，构建了用于分析MSC的BBB通道机制的体外评价体系。从SD-Tg(CAG-EGFP)大鼠中收集并培养所有细胞发出绿色荧光的BMEC，并从大鼠骨髓中收集MSC，培养并用荧光试剂PKH26标记。将 BMEC 接种在细胞培养插入物（膜孔径为 8.0 μm）上，将 10% 胎牛血清添加到插入物的下室，并将 MSC（1.5 × 10^4 个细胞/cm^2）添加到上室。，24小时后固定观察。虽然 BMEC 的形态或单层结构没有观察到显着变化，但观察到许多 MSC 穿过 BMEC 层并粘附到 BMEC 下方的膜上。此外，还观察到穿过孔并粘附在膜背面的MSC。为了阐明 MSC 如何穿过 BMEC 层，我们使用延时成像观察了两种细胞的动态。结果，观察到 MSC 通过细胞旁途径穿过 BMEC 层。还观察到，当MSC穿过BMEC层时，BMEC间隙暂时变宽，通过后间隙闭合并恢复到原始状态。如上所述，在本研究中，我们成功构建了一个体外实验系统，使我们能够评估和观察 MSC 穿过 BMEC 层的通道，并使用该实验系统，我们揭示了 MSC 穿过 BMEC 层的途径路线。