新規対イオン-ポリアルギニン併用系を用いた光親和性標識による細胞内相互作用の検出

使用新型抗衡离子-聚精氨酸组合系统通过光亲和标记检测细胞内相互作用

基本信息

批准号：
09F09132
负责人：
二木史朗
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は細胞内での代謝や情報伝達、あるいは細胞内での分子相互作用を検出するための手法を開発することである。この目標達成のために、まず、細胞外環境での光反応性架橋の条件に関して確立することを目指した。トリフルオロメチルジアジリンフェニルアラニンを光反応基として用い、さらに架橋された膜関連分子の単離を容易にするためにビオチンを導入したアルギニン12量体(R12)をベクターとし、光架橋のための最適な条件を検討した。細胞膜と強い相互作用を示すR12ベクターを生理活性分子とし、光反応性修飾基に関しては、フェニルアラニン誘導体を用いたが、標準的なFmoc固相合成法でペプチド鎖の特定の位置に導入出来、有用であった。このペプチドとHeLa細胞とを様々な条件下にインキュベーションした後、紫外線照射を行い、細胞を溶解後架橋された分子を単離し、標的となったタンパク質を質量分析等で解析した結果、R12の内在化に関与している受容体として、HIVの感染共受容体でもあるCXCR4が明らかとなった。一方では、細胞内タンパク質による細胞膜の曲率誘導が近年注目されており、この曲率誘導を掌るペプチド配列を用いての細胞膜操作や機能性分子の細胞内送達が期待できる。本研究では、この基礎的知見を得るために、エンドサイトーシス関連タンパク由来の曲率誘導ペプチド4種を合成し、細胞膜ならびに人工脂質膜との相互作用に関して検討したところ、これらのペプチドの中には、細胞内に巨大液胞を発生させたり、細胞を縮ませる効果のあるものがあることを見いだした。

这项研究的目的是开发用于检测细胞内代谢，信号传递或分子相互作用的方法。为了实现这一目标，我们首先旨在确定细胞外环境中光电反应性交联的条件。将三氟甲基二氮嗪苯丙氨酸用作光电反应性基团，并促进交联膜相关分子的分离，研究了一种精氨酸12mer（R12）作为载体，并研究了光链接链接的最佳条件。 R12载体与细胞膜表现出很强的相互作用，用作生物活性分子，并且光电反应性修饰组是苯丙氨酸衍生物，但很有用，因为它可以使用标准FMOC固相的FMOC固相合成来将其引入肽链中的特定位置。在各种条件下孵育肽和HeLa细胞后，进行了紫外线照射，并分离了交联的分子，并通过质谱法分析了靶蛋白，而其他分析则揭示了CXCR4，一种涉及HIV的感染者，作为HIV，作为R12内在的受体。另一方面，近年来，通过细胞内蛋白诱导细胞膜的曲率一直引起人们的注意，并且可以使用控制曲率诱导的肽序列的肽序列来期望预期细胞膜操纵和功能分子的细胞内递送。在这项研究中，为了获得这种基本知识，合成了从与内吞作用相关的蛋白得出的四种曲率诱导肽，并研究了与细胞膜和人工脂质膜的相互作用。我们发现其中一些肽具有在细胞内产生巨型液泡并缩小细胞的作用。