細胞内可視化・ハイスループット検出系創出のための効率的細胞導入法

用于细胞内可视化的高效细胞引入方法和高通量检测系统的创建

基本信息

批准号：
19021025
负责人：
二木史朗
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

分子認識能を有する蛋白質や核酸を適当な蛍光団などで化学修飾することにより、様々なテーラーメイドのセンサー分子が設計可能であり、細胞内情報の可視化やこれに基づく生理活性物質のハイスループット検出への応用が期待される。しかし、このような分子を効果的に細胞に導入する方法がないことが実用化の障害になっている場合も多い。申請者は、アルギニンペプチドを移送ベクターとして蛋白質や様々な分子を細胞内に導入する際に、ピレンブチレートなどの疎水性対イオンを共存させることにより、導入効率は数倍から数十倍に向上することを見いだしている。本年度は、この方法を応用して、15Nラベルしたタンパク質(ユビキチン)を細胞内に導入し、NMRを用いて細胞内でのタンパク質の姿をその場計測することに世界に先駆けて成功した。また、この方法が細胞内の薬物とタンパク質の相互作用を解析することや、タンパク質のフォールディングの安定性の検討にも応用出来ることを示した。一方では、既存のタンパク質とアルギニンペプチドとの架橋体をワンポットで容易に形成する試薬の開発にも成功した。さらに、アルギニンペプチドの代わりにpH感受性膜融合ペプチドを移送ベクターとして用い、カチオン性リポソームを取り込み時に介在させることで効率よい細胞内移送を達成する新しい系を開発した。アルギニンペプチドは塩基性、pH感受性膜融合ペプチドは酸性アミノ酸に富むために、導入する物質の荷電状態に応じて使い分けることも可能と考えられ、細胞内可視化・ハイスループット検出系創出のための効率的細胞導入法の開発に成功した。

通过化学修饰蛋白质和合适的荧光团蛋白质，可以设计各种泰勒制造的传感器分子，并有望将其用于可视化细胞内信息和基于此的生理活性物质的高通量检测。但是，缺乏有效地将这种分子引入细胞的方法通常是对实际使用的阻碍。申请人发现，当将精氨酸肽作为转移载体引入细胞时，可以共存疏水词，例如丁酸丁酸酯，从而导致引入效率的提高效率几次到几十次。今年，今年，我们是世界上第一个成功将15N标记蛋白（泛素）转移到细胞中，并使用NMR在细胞中测量蛋白质的外观。它还表明，该方法可以应用于分析细胞内药物与蛋白质之间的相互作用，并研究蛋白质折叠的稳定性。另一方面，我们还成功地开发了一种试剂，该试剂可以轻松地在一个锅中的现有蛋白质和精氨酸肽之间形成一个交联的身体。此外，已经开发了一种新系统，该系统使用pH敏感的膜融合肽作为转移载体代替精氨酸肽，并通过介入摄取过程中阳离子脂质体，从而实现有效的细胞内转移。由于精氨酸肽富含碱性，因此认为pH敏感的膜融合肽可以根据所引入的物质的电荷状态使用，并且我们成功地开发了一种有效的细胞内可视化和高通量检测系统的细胞介绍方法。