細胞内可視化・ハイスループット検出系創出のための効率的細胞導入法

用于细胞内可视化的高效细胞引入方法和高通量检测系统的创建

基本信息

批准号：
19021025
负责人：
二木史朗
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

分子認識能を有する蛋白質や核酸を適当な蛍光団などで化学修飾することにより、様々なテーラーメイドのセンサー分子が設計可能であり、細胞内情報の可視化やこれに基づく生理活性物質のハイスループット検出への応用が期待される。しかし、このような分子を効果的に細胞に導入する方法がないことが実用化の障害になっている場合も多い。申請者は、アルギニンペプチドを移送ベクターとして蛋白質や様々な分子を細胞内に導入する際に、ピレンブチレートなどの疎水性対イオンを共存させることにより、導入効率は数倍から数十倍に向上することを見いだしている。本年度は、この方法を応用して、15Nラベルしたタンパク質(ユビキチン)を細胞内に導入し、NMRを用いて細胞内でのタンパク質の姿をその場計測することに世界に先駆けて成功した。また、この方法が細胞内の薬物とタンパク質の相互作用を解析することや、タンパク質のフォールディングの安定性の検討にも応用出来ることを示した。一方では、既存のタンパク質とアルギニンペプチドとの架橋体をワンポットで容易に形成する試薬の開発にも成功した。さらに、アルギニンペプチドの代わりにpH感受性膜融合ペプチドを移送ベクターとして用い、カチオン性リポソームを取り込み時に介在させることで効率よい細胞内移送を達成する新しい系を開発した。アルギニンペプチドは塩基性、pH感受性膜融合ペプチドは酸性アミノ酸に富むために、導入する物質の荷電状態に応じて使い分けることも可能と考えられ、細胞内可視化・ハイスループット検出系創出のための効率的細胞導入法の開発に成功した。

各种量身定制的传感器分子可以通过具有适当的荧光基团的分子识别的化学和修饰蛋白质和核酸来设计，并且可以根据这种情况将其可视化细胞内信息和高斜率的高斜率。。但是，在许多情况下，没有办法有效地将这种分子引入细胞中的实际障碍。通过将蛋白质和各种分子作为转移载体引入氧化物时，申请人已经将疏水性螯合物等疏水性螯合物（如pyrememve螯合物）提高到了几十万次。在这个财政年度，应用了这种方法，世界在世界上成功地将15N标记的蛋白质（泛素）引入细胞中，并使用NMR测量细胞中蛋白质的外观。这也表明，该方法可用于分析细胞中药物与蛋白质之间的相互作用以及蛋白质折叠的稳定性的研究。另一方面，它成功地开发了一种试剂，该试剂可以轻松地在一个斑点中在现有蛋白质和精氨酸肽之间形成桥梁。此外，已经开发了一种新系统，以通过使用pH敏感肽作为转移载体而不是精氨酸肽作为转移载体来实现有效的细胞内转移。精氨酸肽是一种基本的pH值膜融合肽，因此可以根据要引入的物质的充电状态使用它，因此有效的细胞可用于细胞内可视化和高环形检测系统引入方法的开发。