膜外シグナルによる膜内ペプチドの会合調節を利用した膜電流制御システムの構築

利用膜外信号调节膜内肽缔合构建膜电流控制系统

基本信息

批准号：
13022234
负责人：
二木史朗
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13022234/
关键词：
自己組織化超分子化学イオンチャネル膜電流ペプチド工学アラメチシンロイシンジッパーナノテクノロジー人工イオンチャネル人工レセプター合成ペプチド膜外構造スイッチ α-ヘリックス人工センサー膜タンパク質

项目摘要

タンパク質などのリガンドの存在、あるいは膜界面におけるタンパク質間の相互認識をチャネル電流変化として捉える系の開発を目指して、グラミシジンのC末端側にピオチンを導入したハイブリッドペプチド(Gram-Bio 1)を合成した。電解質(1M KCl)に0.1μM程度のストレプトアピジンを添加することにより、このチャネル電流は、数分で顕著に抑制されることが分かった。また、電解質にビオチンヒドラジドを添加することにより、電流レベルほぼ元のレベルに復帰した。電流抑制効果はストレプトアビジンの濃度に相関しており、チャネルペプチドの機能化により、結合定数が10^<8-9> M^<-1>程度の特異的なタンパク質間の相互作用をリアルタイムで感知可能な系が創出できた。また、グラミシジンの代わりにアラメチシンをチャネルペプチドとして用いた場合にも同様の結果が得られた。チャネルの平均開口時間を検討した結果、ストレプトアビジン添加により、1の膜内での移動速度が低下することで導電性の二量体の形成確率が低下したか、もしくは、ストレプトアビジンとビオチンの結合により1が膜外に引き抜かれたことが、開口時間の減少につながったと推測された。一方、ビオチンの代わりにアダマンタン、あるいはストレプタグIIとよばれるストレプトアビジン結合ペプチド)をグラミシジンのC末端に導入したペプチドを調製した。しかし、β-シクロデキストリンやストレプトアビジンをこれらの系に添加しても、膜電流の顕著な抑制は認められなかった。これらのリガンド-レセプター間の結合定数は10^5 M^<-1>以下と推定され、グラミシジンを用いる系でタンパク質相互作用を検討しようとする場合には10^<8-9> M^<-1>程度の結合定数が必要である可能性が示唆された。

为了开发一种系统，该系统捕获了随着通道电流的变化而捕获蛋白质（蛋白质）的存在，例如蛋白质或蛋白质之间的相互识别，合成了在Gramicidin的C-末端引入piotin的混合肽（Gram-Bio 1）。已经发现，通过在电解质（1M KCL）中添加约0.1μM链霉亲和素，该通道电流在几分钟内被显着抑制。此外，通过将氢氮化物添加到电解质中，电流水平几乎恢复到原始水平。当前的抑制作用与链霉亲和素的浓度相关，并通过通道肽的功能化，该系统能够实时检测具有约10^<8-9> M^<-1>的结合常数特定蛋白质相互作用。当将芳氨甲素用作通道肽而不是gramicidin时，也获得了类似的结果。由于检查了通道的平均开放时间，据推测，链霉亲和素的添加降低了1膜内的运动速度，从而降低了形成导电二聚体的可能性，或者由于链霉亲和生物素的结合，从膜上提取了1个，导致开放时间的降低。另一方面，在gramicidin的C-末端引入了一种称为链球菌II的阿甘坦或链霉亲和蛋白结合肽的肽，而不是生物素。然而，即使将β-环糊精和链霉亲和蛋白酶添加到这些系统中，也未观察到膜电流的显着抑制。这些配体受体之间的结合常数估计低于10^5 m^<-1>，这表明在尝试使用gramicidin在系统中研究蛋白质相互作用时，可能需要约10^<8-9> m^<-1>的结合常数。