膜外シグナルによる膜内ペプチドの会合調節を利用した膜電流制御システムの構築

利用膜外信号调节膜内肽缔合构建膜电流控制系统

基本信息

批准号：
13022234
负责人：
二木史朗
金额：
$ 2.69万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13022234/
关键词：
自己組織化超分子化学イオンチャネル膜電流ペプチド工学アラメチシンロイシンジッパーナノテクノロジー人工イオンチャネル人工レセプター合成ペプチド膜外構造スイッチ α-ヘリックス人工センサー膜タンパク質

项目摘要

タンパク質などのリガンドの存在、あるいは膜界面におけるタンパク質間の相互認識をチャネル電流変化として捉える系の開発を目指して、グラミシジンのC末端側にピオチンを導入したハイブリッドペプチド(Gram-Bio 1)を合成した。電解質(1M KCl)に0.1μM程度のストレプトアピジンを添加することにより、このチャネル電流は、数分で顕著に抑制されることが分かった。また、電解質にビオチンヒドラジドを添加することにより、電流レベルほぼ元のレベルに復帰した。電流抑制効果はストレプトアビジンの濃度に相関しており、チャネルペプチドの機能化により、結合定数が10^<8-9> M^<-1>程度の特異的なタンパク質間の相互作用をリアルタイムで感知可能な系が創出できた。また、グラミシジンの代わりにアラメチシンをチャネルペプチドとして用いた場合にも同様の結果が得られた。チャネルの平均開口時間を検討した結果、ストレプトアビジン添加により、1の膜内での移動速度が低下することで導電性の二量体の形成確率が低下したか、もしくは、ストレプトアビジンとビオチンの結合により1が膜外に引き抜かれたことが、開口時間の減少につながったと推測された。一方、ビオチンの代わりにアダマンタン、あるいはストレプタグIIとよばれるストレプトアビジン結合ペプチド)をグラミシジンのC末端に導入したペプチドを調製した。しかし、β-シクロデキストリンやストレプトアビジンをこれらの系に添加しても、膜電流の顕著な抑制は認められなかった。これらのリガンド-レセプター間の結合定数は10^5 M^<-1>以下と推定され、グラミシジンを用いる系でタンパク質相互作用を検討しようとする場合には10^<8-9> M^<-1>程度の結合定数が必要である可能性が示唆された。

为了开发一种系统，通过通道电流的变化来检测蛋白质等配体的存在或膜界面蛋白质之间的相互识别，我们合成了一种混合肽（Gram-Bio 1），其中在C末端引入了piotin短杆菌肽。结果发现，通过向电解质（1M KCl）中添加约 0.1 μM 链霉蛋白酶，该通道电流在几分钟内得到显着抑制。此外，通过向电解质中添加生物素酰肼，电流水平几乎恢复到原来的水平。电流抑制效果与链霉亲和素的浓度相关，并且通过使通道肽功能化，可以实时检测结合常数为约10^<8-9>M^<-1>的特异性蛋白质-蛋白质相互作用。能够创建一个传感系统。当使用阿拉甲霉素代替短杆菌肽作为通道肽时，也获得了类似的结果。通过检查通道的平均开放时间，发现链霉亲和素的添加降低了1在膜内的移动速率，从而降低了形成导电二聚体的可能性，或者链霉亲和素和生物素结合据推测，1被从膜中拉出，导致开放时间减少。另一方面，制备了一种肽，其中将金刚烷（或称为Streptag II的链霉亲和素结合肽）代替生物素引入短杆菌肽的C末端。然而，即使将β-环糊精或链霉亲和素添加到这些系统中，也没有观察到膜电流的显着抑制。这些配体和受体之间的结合常数估计小于 10^5 M^<-1>，当尝试使用短杆菌肽研究系统中的蛋白质相互作用时，估计结合常数为 10^<8- 9> M^< 有人建议结合常数-1>可能是必要的。