ペプチドマトリクスを使った高分子量タンパク質の細胞内送達

使用肽基质进行高分子量蛋白质的细胞内递送

• 批准号: 14657589
• 负责人: 二木 史朗
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657589/
• 关键词: 合成ペプチド; 高分子; タンパク質; 薬物送達; 動物細胞; 医薬品; DDS; ペプチド工学; 合成ペプチド; 高分子; タンパク質; 薬物送達; 動物細胞; 医薬品; DDS; ペプチド工学

近年、HIV-1 Tat由来の塩基性ペプチドが効率的に細胞膜を透過することが明らかとなり、これをキャリアとしたタンパク質の細胞内導入が報告されている。これらのアプローチにおいては、予め分子内にこれらの配列を組み込んだ形でタンパク質を遺伝子工学的あるいは化学的に調製するか、もしくは、これらのペプチドと目的のタンパク質とを化学的に架橋する必要があり、煩雑な操作が必要であった。この問題の解決のため、本研究では、システインを含んだ疎水化アルギニンペプチドをマトリクスとして用い、目的タンパク質との非共有結合的複合体を形成するアプローチによる細胞内導入法に関して検討を行った。まず、申請者が細胞内DNA導入用に開発したステアリルオクタアルギニンをベースに、分子内にシステインの導入を行い、S-S架橋によりマトリクス構造の安定化を図るとともに、細胞内の還元的環境下でこれらが開裂し、目的タンパク質を放出するようデザインをおこなった。ペプチド合成はFmoc固相法を用いて行い、脱保護後、HPLCを用いて精製した。このペプチドとGFP(緑色蛍光タンパク質)のタンパク質などを混合することにより、タンパク質の細胞内導入を図ったが、おそらくはペプチド中の疎水基とタンパク質との疎水結合が効果的に形成できないために良好な結果は得られなかった。次に、遺伝子工学的に作製したタンパク質の精製にしばしば用いられるヒスチジンタグに着目し、アルギニンペプチドにニッケルキレートを導入し、これとヒスチジンタグを有するGFPを細胞内に導入したところ、共有結合的に結合した場合よりは効率が若干劣ったものの、確かに細胞内への取り込みが促進されることが分かった。現在、これらの系の条件等を詳細に検討することにより、効率の向上を図っている。

最近，已经揭示了从HIV-1 TAT衍生的碱性肽有效地渗透到细胞膜，并且已经报道了使用该蛋白作为载体的细胞内引入蛋白质。在这些方法中，必须通过将这些序列提前掺入分子中，或将这些肽与感兴趣的蛋白质进行化学交联，这需要复杂的操作，或者将这些肽交联通过化学交联。为了解决这个问题，本研究使用含有半胱氨酸作为基质的疏水精氨酸肽进行了细胞内引入方法，并形成与靶蛋白的非共价复合物。首先，基于申请人为细胞内DNA引入而开发的硬氧氧化氨酸氨酸，将半胱氨酸引入分子中，并使用S-S-S交联成来稳定基质结构，并进行了设计，以使其在细胞内的还原环境中切开并释放靶蛋白。使用FMOC固相法，脱身，然后使用HPLC纯化肽合成。该肽与蛋白质（例如GFP（绿色荧光蛋白））将蛋白质引入细胞中，但是不可能在肽中疏水基团之间的疏水键，并且无法有效形成蛋白质，因此无法获得良好的结果。接下来，我们专注于组氨酸标签，该标签通常用于净化遗传学的蛋白质，当将镍螯合物引入精氨酸肽和GFP中时，将带有组氨酸标签的GFP引入了细胞中，尽管效率略低于协调结合时，确实发现它确实促进了细胞的摄入量。当前，通过详细检查这些系统，可以提高效率。