真核生物の染色体DNA複製再構成系の確立

真核染色体DNA复制和重排系统的建立

基本信息

批准号：
20657028
负责人：
水島徹
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20657028/
关键词：
真核生物染色体DNA複製生化学的解析 ORC pre-RC DNA複製 Cdc6p

项目摘要

真核生物の染色体DNA複製研究の大きな障害になっているのは、酵母を始め真核生物では染色体DNA複製の試験管内再構成系が確立されていないために、生化学的解析が充分に行えないことである。遺伝学的研究から、真核生物の染色体DNA複製反応は、複製開始点に順番に種々の因子が結合して開始されることが示唆されている。複製開始点に常に結合しているORC(Origin Recognition Complex)にまずCdc6pが結合し、次にCdtlpとMCMが結合し、pre-RCと呼ばれる複製前複合体がG1期に形成されることがその第一段階と考えられている。最近我々は、真核生物の染色体DNA複製の最初の段階であり、かつ律速段階と考えられている、origin DNA(複製開始点を含むDNA)上でのORCとCdc6pによる複合体形成の試験管内再構成に、酵母を使って世界で初めて成功した(Mizushima et al. Genes&Dev. 2000)。また最近、この複合体にさらにCdtlpとMCMを結合させることにより、pre-RCを試験管内で再構成することに成功した。今後は、このシステムを土台に真核生物の染色体DNA複製の試験管内再構成系を確立することである。具体的には、pre-RCがサイクリン依存性キナーゼにより活性化されると共に、Cdc45pなどが結合しpre-ICが形成されるので、この複合体にサイクリン-サイクリン依存性キナーゼ複合体やCdc45pなどを作用させ、pre-ICを試験管内で再構成する。

研究真核生物中染色体DNA复制的一个主要障碍是，在酵母和其他真核生物中尚未建立染色体DNA复制的体外重建系统，因此很难进行足够的生化分析。遗传学研究表明，真核染色体 DNA 复制是由各种因子顺序结合到复制起点启动的。这是由于Cdc6p首先与ORC（Origin Recognition Complex）结合，ORC始终与复制起点结合，然后Cdtlp与MCM结合，在G1期形成称为pre-RC的复制前复合物。被认为是第一阶段。最近，我们在体外研究了ORC和Cdc6p在原始DNA（含有复制起点的DNA）上形成复合物，这是真核染色体DNA复制的第一步和限速步骤，世界上首次使用酵母成功重建。（Mizushima 等人 Genes&Dev. 2000）。此外，我们最近通过进一步将 Cdtlp 和 MCM 与该复合物结合，成功地在体外重建了 pre-RC。我们未来的目标是基于该系统建立真核染色体DNA复制的体外重建系统。具体来说，pre-RC被细胞周期蛋白依赖性激酶激活，与Cdc45p等结合形成pre-IC，在体外重构pre-IC。