真核生物の染色体DNA複製再構成系の確立と複製開始制御機構の解明

真核染色体DNA复制重建体系的建立及复制起始控制机制的阐明

基本信息

批准号：
16026227
负责人：
水島徹
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16026227/
关键词：
染色体DNA複製再構成系複製開始制御機構 ATP ORC

项目摘要

本研究の目的は、大腸菌での研究経験を活かしながら、酵母のDNA複製開始制御機構を、試験管内再構成系の確立、及び複製開始蛋白質に結合しているアデニンヌクレオチドによる制御という二つの観点から、生化学的に研究することである。我々は、ATPと結合できない変異Orc5pを発現する酵母変異株、orc5-A株を構築し、その解析を行った。具体的には、(1)ORC、及びCdc6pに関して、ATP/ADP結合、及びATPase活性を調節する因子の検索を行う、及び(2)ORCのATP/ADP結合、及びATPase活性に開する遺伝学的解析を行う、(3)真核生物の染色体DNA複製全体の再構成を行う、以上3点の研究を行う。(1)ORC、及びCdc6pに関して、ATP/ADP結合、及びATPase活性を調節する因子の検索に関して今年度我々は、酵母核粗抽出液中に、ORC、及びCdc6pのATP/ADP結合、及びATPase活性を促進する活性を見いだした。さらにこれらの活性を、SDS-PAGE上単一なバンドを示すまでに精製した。(2)ORCのATP/ADP結合、及びATPase活性に開する遺伝学的解析に関して今年度我々は、昨年度構築したATPと結合できない変異Orc5pを発現する酵母変異株、orc5-A株を用いて、この株ではOrc5pサブユニットがユビキチン化されるために、プロテアソームにより分解されることを見いだした。(3)真核生物の染色体DNA複製全体の再構成に関して今年度我々は、再構成に必要な全ての蛋白質の精製を完了した。以上の結果から、Orc5pのATP結合活性は、Orc5pとOrc4pの相互作用に必要であり、この相互作用はORCが細胞内で安定に存在するため重要であることが考えられる。

本研究的目的是利用我们在大肠杆菌中的研究经验，从建立体外重建系统和通过与复制起始蛋白结合的腺嘌呤核苷酸控制两个角度来研究酵母DNA复制起始控制机制，并进行生化研究。。我们构建了orc5-A，一种表达不能结合ATP的突变Orc5p的酵母突变菌株，并对其进行了分析。具体来说，我们将（1）寻找调节ORC和Cdc6p的ATP/ADP结合和ATP酶活性的因素，以及（2）研究与ORC的ATP/ADP结合和ATP酶活性相关的遗传学（3）整个染色体的重建。真核生物中的 DNA 复制。 (1) 寻找调节 ORC 和 Cdc6p 的 ATP/ADP 结合和 ATPase 活性的因子今年，我们研究了粗酵母核提取物中 ORC 和 Cdc6p 的 ATP/ADP 结合和 ATPase 活性，结果发现该活性促进。这些活性被进一步纯化到在 SDS-PAGE 上观察到单个条带的程度。 (2)关于ORC的ATP/ADP结合和ATP酶活性的遗传分析，今年我们使用了orc5-A菌株，这是我们去年构建的表达不能结合ATP的突变Orc5p的酵母突变菌株。在该菌株中，Orc5p 亚基被泛素化，因此被蛋白酶体降解。（3）关于整个真核染色体DNA复制的重建，今年我们完成了重建所需的所有蛋白质的纯化。根据以上结果，认为Orc5p的ATP结合活性对于Orc5p和Orc4p之间的相互作用是必要的，并且这种相互作用是重要的，因为ORC稳定地存在于细胞中。