蛋白質の活性に着目した、新しい網羅的遺伝子解析の試み

聚焦蛋白质活性的综合遗传分析新尝试

基本信息

批准号：
16013234
负责人：
水島徹
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16013234/
关键词：
蛋白質網羅的遺伝子解析 ATP結合 DnaA ORC

项目摘要

我々は、それぞれの活性を介して発現が変化する遺伝子の同定に必要な、ATP結合、重合、膜リン脂質結合、ATPase活性部位に変異を持つ、温度感受性dnaA変異株の作成を行った。そして重合活性に関する変異株とDNAチップ技術を用いて、変異により発現が変化する遺伝子の同定を行った。数多くの遺伝子が同定されたが、特にDnaKなど分子シャペロン関連の遺伝子が多かった。一方我々はGST Pull-downアッセイを用いた方法で、DnaAの重合活性依存にDnaAに結合する蛋白質を検索した。興味深いことにやはり分子シャペロンが同定された。以上の結果から我々は、DnaAの重合に分子シャペロンが関与しているのではないかと考え、実際に記験管内複製再構成系を用いて、精製したDnaKがDnaへの重合を促進し、DNA複製を促進することを見出した。これまでdnaK変異株がなぜdnaの性質を示す(DNA複製を行えない)のかは不明であったが、この研究によりDnAへの重合を促進するためであることが分かった。一方、ATP結合活性に関しても同様の解析を行い、DnaB蛋白質(DNAヘリカーゼ)とDnaAの結合がDnaAのATP結合に依存していることを見出した。この結果は、ATP結合型DnaAがDnaBを複製開始点に導入し複製が開始され、その後、DnaAのATPase活性が促進されDnaAがADP型に変化するとDnaBがDnaへから離れ複製反応が進行する(DNAヘリカーゼは複製フォークと共にゲノム上を移動する必要がある)という機構の存在を示唆している。一方我々は酵母の複製開始蛋白質ORCに関してこれまで、DnaAとの共通性という独自の観点から生化学的に研究してきた。その結果ORCもDnaA同様、ATP結合、ATPase、膜結合、重合など、様々な生化学的活性を持つ蛋白質であることが分かった。

我们创建了一个温度敏感的DNAA突变体，该突变体是鉴定其表达通过其活性而变化的基因，其ATP键，超平坦，膜磷脂键以及ATPase活性位点中的突变。然后，使用与聚合活性相关的突变体和DNA芯片技术，该基因的表达因突变而变化。鉴定出许多基因，但有许多分子雪佩（Cheperon）相关的基因，尤其是DNAK。另一方面，我们搜索了与DNAA结合DNAA的聚合活性依赖DNAA的蛋白质，以使用GST下拉测定法。有趣的是，确定了分子伴侣。基于上述结果，我们认为分子Cheperon参与了DNAA的聚合，并且纯化的DNAK使用双重构建性重新介绍系统促进了DNA的聚合，我发现它促进了重复。到目前为止，尚不清楚为什么DNAK突变股票表明DNA的性质（不能重复DNA），但是这项研究发现它是为了促进DNA聚合化。另一方面，对ATP结合活性进行了类似的分析，发现DNAB蛋白（DNA解旋酶）和DNAA结合取决于DNAA ATP键。结果，当将ATP结合型DNAA引入DNAB的复制点时，启动了重复，然后促进DNAA ATPase活性并将DNAA变化为ADP类型，DNAB将从DNA和DNA中扣除。繁殖反应将进行DNA解旋酶，这表明存在一种机制，需要在基因组上与重复的叉子一起移动。另一方面，我们从与DNAA的共同点的独特角度研究了酵母重复的蛋白ORC。结果，发现兽人（如DNAA）是具有各种生化活性的蛋白质，例如ATP键，ATPase，ATPase，膜键和聚合。