DNA二重鎖切断の認識・修復の分子機構の解明とがん放射線治療への応用

阐明DNA双链断裂识别和修复的分子机制及其在癌症放疗中的应用

基本信息

批准号：
08F08468
负责人：
松本義久
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08F08468/
关键词：
DNA修復 DNA-PK XRCC4 XLF (Cernunnos)タンパク質リン酸化放射線感受性 XLF(Cernunnos)

项目摘要

最終年度にあたる本年度は、DNA-PKによるXRCC4タンパク質のリン酸化の詳細な検討と意義の解析を中心に行った。前年度までに、XRCC4のリン酸化部位を計4カ所同定し、既報の1カ所を加え、計5カ所の部位に対するリン酸化状態特異的抗体を作製し、変異体を発現する細胞を樹立した。リン酸化状態特異的抗体を用いたウェスタン・ブロッティング法により、全ての部位において細胞内でリン酸化が起こっていることが確認された。既報の1カ所については放射線照射によるリン酸化状態の変化は認められなかったが、我々が同定した4カ所はいずれも放射線照射後の亢進が認められた。DNA-PK欠損細胞、DNA-PKおよびATM阻害剤の効果などを検討した結果、2カ所については、DNA-PK欠損細胞あるいはDNA-PK阻害剤下での減弱を確認することができた。また、変異体を発現する細胞について解析を行った結果、2カ所のリン酸化部位を欠損する細胞で、放射線感受性の亢進が認められたことから、DNA修復において重要な役割を担うリン酸化部位であることが示唆された。この意義を明らかにするために、リン酸化によるタンパク質間相互作用の調節の可能性を探った。まず、FHAドメインを有するタンパク質との相互作用を解析した結果、複数のリン酸化部位の関与に加え、リン酸化に依存しない結合様式の存在が示唆された。また、リン酸化および非リン酸化ペプチドをリン酸化状態特異的に結合する分子の探索を行った。その結果、リン酸化によって結合が増強する分子が1種類、逆に、リン酸化によって結合が減弱あるいは喪失する分子が数種類見出された。DNA-PKによるXRCC4のリン酸化によってこれらの分子との結合、乖離が調節され、このことがDNA二重鎖切断修復に重要である可能性が示唆された。

今年，即最后一年，重点是通过DNA-PK对XRCC4蛋白磷酸化进行详细检查和意义分析。到前一年，我们在 XRCC4 上总共鉴定了四个磷酸化位点，添加了一个先前报道的位点，产生了针对总共五个位点的磷酸化状态特异性抗体，并建立了表达突变体的细胞。使用磷酸化状态特异性抗体的蛋白质印迹证实磷酸化发生在细胞内的所有位点。尽管在先前报道的一个位点中没有观察到由于辐射照射而导致磷酸化状态发生变化，但在我们确定的所有四个位点中，在辐射照射后观察到磷酸化状态增加。通过检查 DNA-PK 缺陷细胞、DNA-PK 和 ATM 抑制剂的作用，我们能够确认在 DNA-PK 缺陷细胞或 DNA-PK 抑制剂存在的情况下两个位置的衰减。此外，通过分析表达突变体的细胞，我们发现缺乏两个磷酸化位点的细胞具有增加的放射敏感性。为了阐明这一点的重要性，我们探索了通过磷酸化调节蛋白质-蛋白质相互作用的可能性。首先，对与含有 FHA 结构域的蛋白质相互作用的分析表明，除了涉及多个磷酸化位点之外，还存在独立于磷酸化的结合模式。我们还寻找特异性结合磷酸化和非磷酸化肽的分子。结果，他们发现了一类分子的结合因磷酸化而增强，而相反，几种类型的分子的结合因磷酸化而减弱或丧失。 DNA-PK 对 XRCC4 的磷酸化调节其与这些分子的结合和解离，表明这对于 DNA 双链断裂修复可能很重要。