DNA依存性プロテインキナーゼの放射線応答における役割

DNA 依赖性蛋白激酶在辐射反应中的作用

基本信息

批准号：
13218041
负责人：
松本義久
金额：
$ 2.94万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)は放射線応答において重要な役割を担うと考えられているが、「真の基質」が明らかになっていない。本研究では、DNAリガーゼIVと複合体を形成してDNA二重鎖切断修復に関わると予想されているXRCC4タンパク質に着目して検討を行った。まず、ヒト培養細胞を用いた実験から、照射後の細胞内でXRCC4のリン酸化が誘導されること、また、リン酸化の誘導にDNA-PKが関わっていることを示した。次に、組換えXRCC4タンパク質と精製DNA-PKを用いて、DNA-PKがXRCC4を直接にリン酸化できることを示した。更に、種々の解析(ホスホアミノ酸分析、caspaseを用いたペプチドマッピング、抗体エピトープマッピング、アラニン置換体作製等)により、3ケ所のリン酸化部位を同定し、リン酸化状態特異的抗体を作製した。ELISA法により特異性の確認を行ったところ、これらの抗体は目的のリン酸化ペプチドには反応したが、非リン酸化ペプチドや別のリン酸化ペプチドにはほとんど反応しなかった。組換えXRCC4にDNA-PKを作用させた後、これらの抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うと、各部位でのリン酸化が見られた。また、それぞれのリン酸化部位のセリンをアラニンに置換した変異体には反応しなかった。これらの結果から、これらの部位が少なくともin vitroではDNA-PKによってリン酸化されること、また、作製した抗体がそれぞれ目的部位のリン酸化状態に特異的に反応していることが確かめられた。今後、これらの抗体を利用し、細胞内でのリン酸化状態について解析を行う予定である。また、以上の検討を行う中で、XRCC4が放射線誘発細胞死の過程で、caspase-3,7様のプロテアーゼによって切断を受けることも見出し、切断部位も明らかにした。

DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）被认为在辐射反应中发挥重要作用，但其“真正的底物”尚未阐明。在这项研究中，我们重点研究了 XRCC4 蛋白，预计它会与 DNA 连接酶 IV 形成复合物，并参与 DNA 双链断裂修复。首先，使用人类培养细胞的实验表明，辐射后细胞中XRCC4被诱导磷酸化，并且DNA-PK参与了磷酸化的诱导。接下来，使用重组XRCC4蛋白和纯化的DNA-PK，我们证明DNA-PK可以直接磷酸化XRCC4。此外，通过各种分析（磷酸氨基酸分析、使用半胱天冬酶的肽图谱、抗体表位图谱、丙氨酸替代物的制备等），鉴定了三个磷酸化位点，并制备了磷酸化状态特异性抗体。当通过 ELISA 确认特异性时，这些抗体与目标磷酸化肽反应，但几乎不与非磷酸化肽或其他磷酸化肽反应。当将DNA-PK应用于重组XRCC4并使用这些抗体进行蛋白质印迹时，在每个位点观察到磷酸化。此外，它对每个磷酸化位点的丝氨酸被丙氨酸取代的突变体没有反应。这些结果证实了这些位点至少在体外被DNA-PK磷酸化，并且所制备的抗体对每个靶位点的磷酸化状态发生特异性反应。未来，我们计划使用这些抗体来分析细胞内的磷酸化状态。此外，通过上述研究，我们发现XRCC4在辐射诱导的细胞死亡过程中被caspase-3,7样蛋白酶裂解，并鉴定了裂解位点。