DNA二重鎖切断の認識・修復の分子機構に基づく放射線感受性予測・制御の新戦略体系

基于DNA双链断裂识别与修复分子机制的放射敏感性预测与控制新策略体系

基本信息

批准号：
17689036
负责人：
松本義久
金额：
$ 18.72万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology (2006-2007)The University of Tokyo (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1.DNA-PKの真の基質とリン酸化の意義を明らかにするため、これまで検討を続けてきたXRCC4と2006年に新規に発見された分子XLF/Cernunnosについて重点的な検討を行った。XRCC4については、昨年度までの研究で明らかになった部位3カ所の他に、新たに1カ所が同定された。この部位については、文献情報等から他の修復酵素との相互作用に関わる可能性が考えられる。XLFについては2カ所のリン酸化部位が同定された。これら3カ所についてリン酸化状態特異的抗体を作製した。2.これまでに、XRCC4が放射線照射後にクロマチンに結合している状態を捉まえる方法を確立した。本年度は、siRNA、阻害剤などを用いてXRCC4の損傷クロマチン結合機構を解析した結果、DNA-PK及び類縁酵素のATMは結合に必要ではないことが分かった。このXRCCクロマチン結合カイネティクスは極めて早く、2Gy照射の場合、直後にピークとなり、30分後にはほとんどもとの状態に戻る。更に、定量的解析の結果、クロマチン結合XRCC4はDNA二重鎖あたり1個から数個と見積もられた。従って、この方法はin vivoでのDNA二重鎖切断修復反応を反映する迅速で微量の反応を捉えるのに優れていると考えられる。また、この方法を利用して、クロマチンごとXRCC4を精製した。この成分を明らかにすることにより、NHEJによるDNA二重鎖切断修復の全体像理解の進展が期待される。3.これまでの研究で、ヒト末梢血リンパ球のDNA-PK活性には大きな個人差があり、がん患者では健常人に比べて低い傾向が観察されていた。その機構について、DNA-PKcs、Ku86、Ku70に共通する転写調節機構の存在が示唆されていた。本年度、バイオインフォマティクスを加えた検討により、細胞周期節に関わるE2F がこの制御に関わっていることが示唆されていた。

1. 为了弄清DNA-PK的真正底物以及磷酸化的意义，我们重点关注了我们一直在研究的XRCC4，以及2006年新发现的XLF/Cernunnos分子。关于XRCC4，除了去年通过研究发现的三个地点外，还确定了一个新地点。根据文献信息，认为该位点可能参与与其他修复酶的相互作用。鉴定出 XLF 的两个磷酸化位点。针对这三个位点生成了磷酸化状态特异性抗体。 2.到目前为止，我们已经建立了一种捕获放射线照射后XRCC4与染色质结合状态的方法。今年，我们利用siRNA和抑制剂分析了XRCC4与受损染色质的结合机制，发现结合不需要DNA-PK和相关酶ATM。这种XRCC染色质结合动力学非常快；在2Gy照射的情况下，它立即达到峰值，并在30分钟后几乎恢复到原始状态。此外，定量分析的结果是，每个DNA双链体中染色质结合的XRCC4的数量估计为一到几个。因此，该方法被认为非常适合捕获反映体内DNA双链断裂修复反应的快速且微小的反应。此外，使用这种方法，我们纯化了 XRCC4 及其染色质。通过阐明这一组成部分，我们希望加深对 NHEJ 修复 DNA 双链断裂的整体图景的理解。 3. 既往研究表明，人外周血淋巴细胞中DNA-PK活性存在较大个体差异，癌症患者的活性往往低于健康个体。关于其机制，有人提出DNA-PKcs、Ku86和Ku70共有的转录调控机制的存在。今年，利用生物信息学的研究表明，参与细胞周期节点的E2F参与了这种调节。