DNA二重鎖切断センサーKuタンパク質から探る温熱の生物作用の基本原理

利用 DNA 双链断裂传感器 Ku 蛋白探索热生物效应的基本原理

基本信息

批准号：
21659285
负责人：
松本義久
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659285/
关键词：
癌放射線温熱療法タンパク質変性 DNA修復 DNA-PK Ku DT40

项目摘要

私はこれまでに、DNA-PKの温熱処理で失活し、その原因はKuサブユニットにあること、温熱によるDNA-PK失活の起こり方は生物種によって異なることを明らかにしてきた。本研究は、44℃までの温熱処理がほとんど生存率に影響しないという特性を持つトリBリンパ球DT40細胞をホスト細胞として用いた遺伝子導入実験により、(1)温熱によるDNA-PK失活の生物種による違いの原因はKuの構造の違いによるものか、また、Ku86、Ku70のどちらに原因があるか、を明らかにする、(2)キメラタンパク質や点変異体の作製、解析により、温熱感受性に関係する構造的要因を探る、(3)温度感受性が異なるKuを発現する細胞における温熱放射線増感効果を検討することにより、温熱の放射線増感作用発現におけるKuの失活の寄与を評価する、ことを目的としている。まず、ホストとなるDT40のKu70およびKu80欠損細胞を入手し、Ku70およびKu80の発現状態やDNA損傷に対する応答性などを調べた。次に、ヒト、マウス細胞からRT-PCR法により、Ku86、Ku70の全長cDNAをクローニングした。なお、遺伝子導入の予備実験を行ったところ、これまでに哺乳類細胞で用いていたベクターおよび遺伝子導入法では、効率やタンパク質発現レベルに問題があったため、ベクターの改変や種々の遺伝子導入法の比較により、最適化を行った。DT40細胞でKu、あるいはDNA-PKのin situでの活性を見るのに簡便でよい方法は従来なかった。そこで、私が哺乳類細胞で見出したXRCC4のリン酸化を用いることを考案し、トリXRCC4遺伝子をクローニングした。その結果、現在データベースに登録されているトリXRCC4は部分断片で、重要な領域が欠けていたことが判明した。

我之前已经表明，DNA-PK 通过热处理而失活，其原因是 Ku 亚基，并且由于热而导致 DNA-PK 失活的发生方式因物种而异。本研究使用禽类B淋巴细胞DT40细胞进行基因转移实验，其特点是热处理至44°C对存活率几乎没有影响，因为宿主细胞之间的差异是由于Ku结构的差异。，还是Ku86或者Ku70引起的？（2）通过嵌合蛋白和点突变体的创建和分析，探索与热敏感性相关的结构因素；（3）表达不同温度敏感性Ku的细胞中的热放射增敏效应本研究的目的是评估Ku失活对热辐射敏感性的影响。热放射增敏技术的发展。首先，我们获得了缺乏Ku70和Ku80的宿主DT40细胞，并检查了Ku70和Ku80的表达状态及其对DNA损伤的反应。接下来，通过 RT-PCR 从人和小鼠细胞中克隆了 Ku86 和 Ku70 的全长 cDNA。基因转移的初步实验表明，迄今为止在哺乳动物细胞中使用的载体和基因转移方法在效率和蛋白质表达水平方面存在问题。迄今为止，尚无方便、良好的方法观察Ku或DNA-PK在DT40细胞中的原位活性。因此，我设计了一种利用我在哺乳动物细胞中发现的XRCC4磷酸化的方法，克隆了禽类XRCC4基因。结果发现，目前数据库中登记的鸟XRCC4是部分片段，缺少重要区域。