グラム陰性菌表層のリポ多糖(LPS)による単球・マクロファージの活性化機構

革兰氏阴性菌表面脂多糖（LPS）激活单核细胞和巨噬细胞的机制

基本信息

批准号：
10178211
负责人：
牟田達史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

単球・マクロファージ細胞膜上のCDl4はグラム陰性菌の外膜に存在するリポ多糖(LPS)を初め、peptidoglycanなどの他の感染菌由来の物質、さらにはアポトーシスを起こした自己の不要な細胞を認識し、細胞の活性化を仲介する“pattern recognition receptor"であり、異物認識の鍵を握る分子と言える。今回我々は、CD14を介した異物認識機構を分子レベルで解明するため、メタノール資化性酵母Pichia pastorisを用いた可溶型ヒトCD14の発現系を構築し、その精製を行った。まず、glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchor型膜結合シグナルとなる8アミノ酸を欠損したヒト可溶型CD14をコードするcDNAを、P.pastorisゲノム内のalcohol oxidase 1(AOX1)遺伝子プロモーターの下流に酸性フオスファターゼ(PHO1)の分泌シグナルとともに相同組み換えにより導入した。得られたtransformantをメタノールを唯一の炭素源として含む培地中で培養することにより発現誘導したところ、培養上清中に分子量55kDaと51kDaの可溶型CD14の発現が認められた。組み換え可溶型CDl4(_<rs>CD14)は、培養上清を硫安沈澱によって濃縮した後、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製_<rs>CDl4とLPSの結合をnativc PAGEによるgel shift法で検討したところ、LPSの存在下で_<rs>CDl4の移動度が変化し、実際に複合体を形成することが確認された。今後、CD14のLPS結合における構造機能相関について解析するとともに、他の感染菌由来物質、アポトーシス細胞の認識における特異性について検討する予定である。

单核细胞和巨噬细胞的细胞膜上的CDl4识别革兰氏阴性菌外膜中存在的脂多糖(LPS)、来自其他感染性细菌的物质如肽聚糖，甚至是已经发生凋亡的不必要的细胞，这是一种“模式识别”。介导细胞活化的“受体”，可以说是异物识别的关键分子。为了在分子水平上阐明CD14介导的外来物质识别机制，我们利用甲醇同化酵母毕赤酵母构建了可溶性人CD14表达系统并进行纯化。首先，编码缺少 8 个氨基酸的人可溶性 CD14 的 cDNA，作为糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定型膜结合信号，被插入到毕赤酵母基因组中的醇氧化酶 1 (AOX1) 基因启动子下游。 PHO1)分泌信号是通过同源重组引入的。当将获得的转化体在含有甲醇作为唯一碳源的培养基中培养以诱导表达时，在培养上清液中观察到分子量为55kDa和51kDa的可溶性CD14的表达。通过硫酸铵沉淀浓缩培养物上清液后，通过离子交换色谱纯化重组可溶性CD14(_ rs CD14)。当使用使用nativc PAGE的凝胶位移法检查纯化的CD14和LPS的结合时，证实了CD14的迁移率在LPS存在下改变并且它实际上形成了复合物。未来，我们计划分析CD14与LPS结合的结构-功能关系，并检查其识别来自其他感染性细菌和凋亡细胞的物质的特异性。