無脊椎動物(カブトガニ)血球細胞上のリポ多糖受容体の遺伝子クローニングと機能解析

无脊椎动物（鲎）血细胞脂多糖受体基因克隆及功能分析

基本信息

批准号：
08680692
负责人：
牟田達史
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

FITCラベルしたLPSを用いたflow cytometryによる解析により、カブトガニ血球細胞はLPS応答性の哺乳類細胞と比較して非常に強いLPS結合能をもつことを見い出した。細胞表面への結合にはhemolymphplasma成分は要求されず、過剰量の無標識LPSによって拮抗がかかること、さらにprotease処理によって結合の減少がみられることから、血球細胞表面に、LPSを直接特異的に認識し結合するタンパク質性因子の存在が示唆された。この因子の実体を明らかにするため、現在、下記のような方法でExpression cloningを進めている。まず、哺乳動物細胞での強力なpromoterであるelongation factor promoterの下流にカブトガニ血球細胞由来cDNAを導入したplasmid expression cDNA libraryを構築した。次に、このlibraryを約2,000cloneづつのsubpoolに分けてplasmidを調製し、LPS結合性を示さないCOS7細胞にcalcium phosphate法により導入した。カブトガニ由来cDNAを発現させた後、上記のflow cytometryの系を利用して、細胞のLPS結合能を検討することにより、陽性クローンを含んだsubpoolを検索しつつある。現在、flow cytometryを用いた検出では、backgroundが高いという欠点があるため、ビオチン化したLPSを用いて、培養ディッシュ上で細胞を染め、陽性反応を示す細胞の同定も同時に試みている。

使用 FITC 标记的 LPS 进行流式细胞术分析表明，与 LPS 响应的哺乳动物细胞相比，鲎血细胞具有更强的 LPS 结合能力。与细胞表面的结合不需要血淋巴质成分，并且会被过量的未标记的LPS拮抗，并且通过蛋白酶处理来减少结合，表明存在识别和结合的蛋白质因子。为了阐明该因子的实质，我们目前正在使用下述方法进行表达克隆。首先，我们构建了一个质粒表达cDNA文库，其中将来自鲎血细胞的cDNA引入到延伸因子启动子的下游，延伸因子启动子是哺乳动物细胞中的强启动子。接下来，将该文库分成约2,000个克隆的子池以制备质粒，使用磷酸钙法将其引入不表现出LPS结合的COS7细胞中。表达鲎衍生的 cDNA 后，我们使用上述流式细胞术系统检查细胞的 LPS 结合能力，寻找含有阳性克隆的子库。目前，流式细胞仪检测存在背景高的缺点，因此我们同时使用生物素化LPS对培养皿中的细胞进行染色，并尝试识别显示阳性反应的细胞。