羊膜を用いて三次元培養皮膚を作り及び臨床応用

利用羊膜制作三维培养皮肤及临床应用

基本信息

批准号：
07F07211
负责人：
橋本公二
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07F07211/
关键词：
培養皮膚羊膜移植再生角化細胞基底膜免疫染色電顕

项目摘要

本研究の具体的な目的は、羊膜を応用することにより、簡便かつ大量作製可能な三次元培養皮膚作成法を確立することである。簡便な方法を確立することができれば、当然大量作製法につながると予想される。昨年度従来の三次元培養皮膚作製方法を改良し、線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に羊膜を密着させ、その上に角化細胞を播種し空気曝露にて重層化させる方法で形態的に優れた三次元培養皮膚を作製する方法を開発した。しかし、コラーゲンゲル作製は非常に複雑であり、作製に時間と手間がかかる。そこで、ゲルを用いないで三次元培養皮膚が作製できないかについて検討した。カルチャーインサートに直接線維芽細胞を播種し、羊膜をカバーしその上に角化細胞を播種し同様に空気曝露にて重層化させた。経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて検索した。HE染色所見ではゲルなし羊膜付き三次元皮膚においても基底細胞は整然と配列し、有棘層の細胞も均一で、形態的に非常に優れた培養皮膚が作製できた。免疫染色にて基底膜構成成分、細胞間接着因子、細胞骨格、分化マーカーなどの発現を比較したところ、基底膜の成分は線状に均一に発現しており、正常皮膚により近い発現様式であった。電子顕微鏡検査ではヘミデスモゾームは発達しており、基底板、稽留繊維も非常にしっかりとしていた。以上の結果より、羊膜を併用することでゲル作製不要の簡易三次元培養皮膚作製法を開発した。

本研究的具体目的是建立一种简单、可大批量利用羊膜制作三维培养皮肤的方法。如果能够建立一种简单的方法，预计自然会导致大规模生产的方法。去年，我们改进了传统的三维培养皮肤生产方法，将羊膜附着在含有成纤维细胞的胶原凝胶上，在其顶部接种角质形成细胞，并在空气中分层，从而产生了优越的形态。三维培养皮肤。然而，胶原蛋白凝胶的生产非常复杂，需要时间和精力。因此，我们研究了是否可以在不使用凝胶的情况下创建三维培养皮肤。将成纤维细胞直接接种到培养插入物上，覆盖羊膜，将角质形成细胞接种在羊膜顶部，并且通过暴露于空气将细胞类似地分层。随着时间的推移收集样品并使用 HE 染色、免疫染色和电子显微镜进行检查。 HE染色结果显示，即使在无凝胶羊膜的三维皮肤中，基底细胞排列有序，棘层细胞也均匀，使得制作形态优良的培养皮肤成为可能。。当我们使用免疫染色比较基底膜成分、细胞间粘附因子、细胞骨架、分化标志物等的表达时，我们发现基底膜成分以线性方式均匀表达，表达模式更接近正常皮肤Ta。。电镜观察显示半桥粒发育良好，基底层和纤维非常坚固。基于以上结果，我们结合使用羊膜，开发了一种不需要凝胶生产的简单三维培养皮生产方法。