レンチウイルスベクターとsh・RNAを用いたノックダウンマウスの作製

使用慢病毒载体和 sh RNA 产生敲除小鼠

• 批准号: 18659325
• 负责人: 橋本 公二
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659325/
• 关键词: Toll-like receptor; sh-RNA; レンチウィルスベクター; ノックダウン; トランスジェニックマウス; TLR2; TLR3; 角化細胞

本研究の目的は、sh-RNA法とレンチウイルスベクターの技術を融合したノックダウンマウスの作製法を樹立することである。この技術が確立されれば低コストで短時間に多くの遺伝子の機能が抑制されたマウスを作製することが可能となり、皮膚科領域のみならず、生物、医学研究の発展に大きな貢献ができるのではないかと考えられる。具体的には、プロトタイプモデルとしてToll-like recptor(TLR)アイソタイプを同時に抑制するトランスジェニックマウスを作成する。TLR2,TLR3の発現を効果的に抑制できるsh-RNAを作製し、レンチウィルスベクターに組み込んだ。このウィルスベクターを角化細胞に導入し、抑制効果を確認した。生後1日の新生児マウス背部皮膚を剥離切除しディスパーゼ処理、続いてトリプシン処理を行い、低カルシウム無血清培地をもちいて表皮細胞を培養した。レンチウイルスベクターをMOI20にて感染し48h後にtotal RNAを回収した。標的配列を持つウイルスの効果をコントロールスクランブル配列と比較してABI prismを用いてreal-time PCRを行った。TLR2,TLR3のリガンド刺激においてシグナル伝達は抑制されていた。レンチウイルスベクターのpLe-U6iのU6 promoterとsh-RNA配列の間にバクテリオファージ由来のloxP配列、終止配列(TTTTTT)、loxP配列をタンデムにつないだスタッファーを挿入しsilent-lentivirus vector(U6LSL-shRNA,LSL=loxP-stop-loxP)を作製した。このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製する準備までは完了したが、実際のマウス作製には至らなかった。

这项研究的目的是建立一种创建敲低小鼠的方法，将SH-RNA方法与慢病毒矢量技术相结合。如果建立了这项技术，则可以在短时间内以低成本产生许多基因的抑制功能的小鼠，并且认为它不仅会对皮肤病学领域做出巨大贡献，而且还将为生物学和医学研究的发展做出巨大贡献。具体而言，作为原型模型，一种同时抑制类似Toll样的Recptor（TLR）同步的转基因鼠标。制备了能够有效抑制TLR2和TLR3表达的SH-RNA并掺入慢病毒载体中。该病毒载体被引入角质细胞中，并确认其抑制作用。出生后的第二天，新生小鼠的背皮被剥落并切除，用配件处理，然后进行胰蛋白酶处理，并使用低钙的无钙血清培养基培养表皮细胞。慢病毒载体被MOI 20感染，并在48小时后收集总RNA。将具有目标序列的病毒与对照争夺序列进行了比较，并使用ABI Prism进行了实时PCR。 TLR2和TLR3的配体刺激抑制信号传导。在慢病毒载体ple-u6i的U6启动子和SH-RNA序列之间插入一个填充器，拟噬菌源的LOXP序列，终止序列（TTTTTTT）和LOXP序列与tandem连接到tandem，以创建一个无声的旋转病毒矢量（U6lslslslslslshrna，lslna，lslna，lsl = loxp）。尽管完成了使用该载体产生转基因小鼠的准备工作，但未实现实际小鼠。

项目成果

Epiregulin, a member of the EGF family, is over-expressed in psoriatic epidermis

• DOI: 10.1016/j.jdermsci.2006.08.010
• 发表时间: 2007-01-01
• 期刊: JOURNAL OF DERMATOLOGICAL SCIENCE
• 影响因子: 4.6
• 作者: Shirakata, Yuji;Kishimoto, Jiro;Hashimoto, Koji
• 通讯作者: Hashimoto, Koji

TAK1 is essential for differentiation and the prevention of apoptosis in epidermis.

TAK1 对于表皮分化和预防细胞凋亡至关重要。

• 发表时间: 2006
• 期刊: The Journal of Biological Chemistry 281
• 作者: Sayama K;Hanakawa Y;Nagai H;Shirakata Y. et al.
• 通讯作者: Shirakata Y. et al.

STAT5a/PPARgamma Pathway Regulates Involucrin Expression in Keratinocyte Differentiation

STAT5a/PPARgamma 通路调节角质形成细胞分化中的外皮蛋白表达

• 发表时间: 2007
• 期刊: J Invest Dermatol 127(7)
• 作者: Dai X;Sayama K;Shirakata Y;Hanakawa Y;Yamasaki K;Tokumaru S;Yang L;Wang X;Hirakawa S;Tohyama M;Yamauchi T;Takashi K;Kagechika H;Hashimoto K
• 通讯作者: Hashimoto K

Hair follicle regeneration using grafted rodent and human cells

使用移植的啮齿动物和人类细胞进行毛囊再生

• 发表时间: 2007
• 期刊: J Invest Dermatol 127(9)
• 作者: Ehama R;Ishimatsu-Tsuji Y;Iriyama S;Ideta R;Soma T;Yano K;Kawasaki C;Suzuki S;Shirakata Y;Hashimoto K;Kishimoto J
• 通讯作者: Kishimoto J

A novel function of angiotensin II in skin wound healing.

血管紧张素 II 在皮肤伤口愈合中的新功能。

• 发表时间: 2006
• 期刊: The Journal of Biological Chemistry 281
• 作者: Yahata Y;Shirakata Y. et al.
• 通讯作者: Shirakata Y. et al.