プラズマ技術を用いた角化細胞・培養皮膚への遺伝子導入法の開発

利用等离子体技术开发角质形成细胞和培养皮肤的基因导入方法

• 批准号: 22659206
• 负责人: 橋本 公二
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22659206/
• 关键词: 遺伝子導入; 角化細胞; プラスマ; 培養皮膚; 遺伝子治療; 細胞障害; 高電界; イオン; 遺伝子導入; 角化細胞; プラスマ; 培養皮膚; 遺伝子治療; 細胞障害; 高電界; イオン

プラズマトランスジェニックスは高電界下でのイオンや反応活性種の働きを利用した全く新たなコンセプトによる分子導入法であり、遺伝子やその他の分子を効率よく簡便かつ迅速に導入することが可能である。本研究ではプラズマによる角化細胞への遺伝子導入の効率、持続性、細胞障害性に関して明らかにし、プラズマによる遺伝子導入角化細胞を用いた培養皮膚の作製の可能性、培養皮膚への直接の遺伝子導入の可能性について明らかにする。正常ヒト皮膚角化細胞を無血清培養法にて培養し、6cmのディッシュに角化細胞を播種し、50%程度のコンフルエンシーとなった時点で遺伝子導入を行った。プラズマ発生装置の可変パラメーラーとしては、電圧、duty,time,rotation speed,gas,gapがあるが、電圧、frequency,gasとgapは一定として、その他を変更し導入効率を観察した。遺伝子はGFPを用いた。プラズマ発生装置にディッシュを装着し、プラズマを照射する装置を用いた。電圧は2万5千ボルトに固定し、周波数は65で固定した。(1)コントロール群(照射なし)(2)duty;40,2秒1回、(3)duty;40,2秒2回、(4)duty;60,2秒1回の4群で比較した。(1)群では細胞に障害性はなく、3日後にはコンフルエントに達した。(2)群では照射直後には一部の細胞で浮遊したものがみられたが90%以上の細胞はダメージを認めず、3日後にはコンフルエントに達したがGFPの発現は全くみられなかった。(3)群では照射直後には照射部に一致して細胞壊死がみられ付着している細胞は10%以下となったが3日目には回復し増殖がみられた。遺伝子の発現はほとんどみられなかった。(4)群では照射部のダメージが強く、ほとんどの細胞が壊死となった。3日目でも細胞は回復せず不可逆的な細胞ダメージであった。遺伝子発現は全くみられなかった。COS7細胞でも同様の条件で遺伝子導入を試みたが10%以下の導入率であり、従来の報告とは異なっていた。プラズマ技術を用いて角化細胞への遺伝子導入を試みたが細胞障害性が高く、導入効率が低いため培養皮膚を用いたex vivo遺伝子治療開発には適さないことが示唆された。

血浆转基因是一个分子引入方法的全新概念，它在高电场下利用离子和反应性物种的功能，从而有效，简单，快速地引入基因和其他分子。这项研究将阐明基因通过血浆转移到角化细胞中的效率，持久性和细胞毒性，以及使用血浆转染的角化细胞产生培养的皮肤的可能性，以及直接基因转移到培养的皮肤中的可能性。使用无血清培养方法培养正常的人皮肤化细胞，将角化细胞播种在6厘米盘中，并在细胞以约50％的汇合汇合时进行基因转移。等离子体发电机的可变参数包括电压，值，时间，旋转速度，气体和间隙，但是电压，频率，气体和间隙是恒定的，其他变化会更改以观察引入效率。 GFP用作基因。血浆发生器配备了盘子，并使用用于照射血浆的设备。电压固定为25,000伏，频率固定为65。比较了四组：（1）对照组（无辐照）（2）义务； 40、2秒一次，（3）义务； 40、2秒两次和（4）义务； 60、2秒一次。 （1）组不是细胞损伤，并且在3天后达到汇合。在第（2）组中，一些细胞在辐照后立即悬浮，但在90％或更多的细胞中未观察到损坏，并且在3天后达到汇合，但未观察到GFP表达。在第（3）组中，在辐照后立即与辐照区域一致观察到细胞坏死，并且附着在辐照区域的细胞数量降低到小于10％，但在第三天，它们恢复和增殖。该基因的表达很少。在（4）组中，受辐照的区域严重损坏，大多数细胞都是坏死的。即使在第三天，细胞也没有回收，并且细胞是不可逆的。未观察到基因表达。在COS7细胞的相同条件下尝试了基因转移，但是基因转移速率为10％或更少，这与以前的报道不同。尽管血浆技术用于将基因转移到角质细胞中，但建议它不适用于使用培养的皮肤的离体基因治疗的发展，因为它具有高度的细胞毒性，并且转移效率较低。