コオロギ色素拡散ホルモン様ペプチドの日周期的発現の分子生物学的解析

蟋蟀色素扩散激素样肽昼夜节律表达的分子生物学分析

基本信息

批准号：
03F00320
负责人：
富岡憲治
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

色素拡散ホルモン様ペプチド(PDF)は昆虫の脳内に広く分布する神経ペプチドであり、概日時計機構に関与することが示唆されている。本研究では、PDFの時計機構への関与を明らかにする第一歩として、1)PDF蛋白質とmRNAの発現の日周リズム、2)PDFの核移行のタイミング、3)PDF発現と核移行のタイミングへの5'-UTRと3'-UTRの関与、の3点を明らかにすることを目的としている。本年度は、1)PDF発現の日周性の検討、および2)pdf mRNA発現の日周性の検討を計画した。まず、単一視葉内でのPDF発現の日周リズムを検討するため、PDFを定量する競合的ELISA法を確立した。脳視葉内からのPDFの抽出については、アセトン、酢酸、エタノール等での抽出を試みた結果、4%酢酸での抽出が最も適していることがわかった。そこで、この手法により、明暗周期下で各時間ごとに視葉から抽出したサンプルを用いて、視葉内PDFの日周変動を解析したところ、明期に少なく暗期に増加する周期的な発現が見られた。明期の中ほどで単一視葉内のPDFは約200fmolであり、暗期の中ほどでピークを示しそのときの含有量は約680fmolであった。したがって,昼夜変動は約3.4倍と見積もられた。現在、恒暗条件下でサンプルを行い、PDF量の概日変動を検討しているところである。Pdf mRNA発現の日周性については、現在in situハイブリダイゼーションを行うためのプローブの設計を行っている。

颜料 - 延伸激素样肽（PDF）是神经肽，广泛分布在昆虫的大脑中，并被认为参与昼夜节律时钟机制。这项研究旨在阐明澄清PDF参与时钟机制的第一步：1）PDF蛋白和mRNA表达的昼夜节奏，2）PDF的核转运时间，以及3）3）5'-utr和3'-utr的参与PDF表达和核转化的时间。今年，我们计划研究1）研究PDF表达的肢体和2）研究PDF mRNA表达的肢体。首先，建立了一种竞争性ELISA方法来量化单个视神经叶中的PDF表达。当从视线叶中提取PDF时，试图用丙酮，乙酸，乙醇等提取，发现使用4％乙酸提取是最合适的。因此，通过使用此技术，使用从光叶和黑暗循环中的每个时间从光叶中提取的样品分析了肾小球中PDF中的昼夜变化，发现在黑暗时期增加了循环表达，而在光周期小于光周期。在光相的中间，单个视神叶中的PDF约为200 fmol，在暗相的中间达到峰值，含量约为680 fmol。因此，估计白天波动约为3.4倍。目前，正在恒定的黑暗条件下进行样品，并且正在研究PDF量的昼夜节律变化。关于PDF mRNA表达的昼夜性质，我们目前正在设计原位杂交的探针。