複数のジスルフィド結合を含む組換タンパク質の高効率巻き戻し系の確立と立体構造解析

含多个二硫键重组蛋白高效解旋体系的建立及三维结构分析

基本信息

批准号：
14780470
负责人：
永田宏次
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

平成14年度は、ジスルフィド結合を3対含むタンパク質の巻き戻し系を確立することに成功した。平成15年度は、その巻き戻し系を用いて試料調製した抗菌ペプチド、オリクチンの立体構造をNMR法により決定した。また同時に、ジスルフィド結合を7対含むタンパク質、前胸腺刺激ホルモンの巻き戻し系の検討を進めた。前胸腺刺激ホルモンを大腸菌で発現させたところ、不溶性の封入体を形成した。通常用いられる大腸菌株BL21(DE3)Star(Invitrogen)に加え、細胞内でのジスルフィド形成が可能な大腸菌の変異株Rosetta-gami B(DE3)(Novagen)も宿主として生産を試みたが、あらゆる条件で不溶性の封入体を形成した。それゆえ、可溶化と巻き戻しについて、種々の条件検討を行った結果、6Mグアニジン塩酸塩による変性・可溶化、その後の希釈法巻き戻しによる立体構造形成により、大部分の前胸腺刺激ホルモンポリペプチド鎖が天然型と同じ二量体を形成することが明らかになった。その後、2段階のカラムクロマトグラフィーにより、この巻き戻し前胸腺刺激ホルモンを精製し、生物活性検定に供したところ、標品と同等の比活性を有した。このように、ジスルフィド結合を7対含むタンパク質、前胸腺刺激ホルモンの立体構造形成にも成功することができた。現在、この巻き戻しにより得られた前胸腺刺激ホルモンをもちいて結晶化実験を行っており、今後、X線結晶構造解析による立体構造解析を進める予定である。

2002年，我们成功建立了含有三对二硫键的蛋白质解旋系统。 2003年，我们利用NMR方法测定了使用解旋系统制备的抗菌肽orictin的三维结构。同时，我们研究了前胸激素的解旋系统，前胸激素是一种含有七对二硫键的蛋白质。当前胸激素在大肠杆菌中表达时，它形成不溶性包涵体。除了常用的大肠杆菌菌株 BL21 (DE3) Star (Invitrogen) 之外，我们还尝试使用能够在所有条件下形成细胞内二硫键的大肠杆菌突变菌株 Rosetta-gami B (DE3) (Novagen) 进行生产形成不溶性包涵体。因此，通过检查各种溶解和解旋条件，我们发现大多数前胸激素多肽可以形成二聚体，与其天然形式相似。此后，通过两步柱层析纯化该解开的促甲状腺激素，并进行生物活性测定，结果发现其具有与标准品同等的比活性。通过这种方式，他们成功地形成了前胸激素的三维结构，这是一种含有七对二硫键的蛋白质。目前，我们正在利用通过该解旋过程获得的前胸激素进行结晶实验，并计划利用X射线晶体结构分析进行三维结构分析。