複数のジスルフィド結合を含む組換タンパク質の高効率巻き戻し系の確立と立体構造解析

含多个二硫键重组蛋白高效解旋体系的建立及三维结构分析

基本信息

批准号：
14780470
负责人：
永田宏次
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

平成14年度は、ジスルフィド結合を3対含むタンパク質の巻き戻し系を確立することに成功した。平成15年度は、その巻き戻し系を用いて試料調製した抗菌ペプチド、オリクチンの立体構造をNMR法により決定した。また同時に、ジスルフィド結合を7対含むタンパク質、前胸腺刺激ホルモンの巻き戻し系の検討を進めた。前胸腺刺激ホルモンを大腸菌で発現させたところ、不溶性の封入体を形成した。通常用いられる大腸菌株BL21(DE3)Star(Invitrogen)に加え、細胞内でのジスルフィド形成が可能な大腸菌の変異株Rosetta-gami B(DE3)(Novagen)も宿主として生産を試みたが、あらゆる条件で不溶性の封入体を形成した。それゆえ、可溶化と巻き戻しについて、種々の条件検討を行った結果、6Mグアニジン塩酸塩による変性・可溶化、その後の希釈法巻き戻しによる立体構造形成により、大部分の前胸腺刺激ホルモンポリペプチド鎖が天然型と同じ二量体を形成することが明らかになった。その後、2段階のカラムクロマトグラフィーにより、この巻き戻し前胸腺刺激ホルモンを精製し、生物活性検定に供したところ、標品と同等の比活性を有した。このように、ジスルフィド結合を7対含むタンパク質、前胸腺刺激ホルモンの立体構造形成にも成功することができた。現在、この巻き戻しにより得られた前胸腺刺激ホルモンをもちいて結晶化実験を行っており、今後、X線結晶構造解析による立体構造解析を進める予定である。

2002年，我们成功建立了一个包含三对二硫键的蛋白质放松系统。在2003年，NMR确定了使用放松系统制备的抗菌肽和orictin的三维结构。同时，我们研究了一种丙硫基象征激素的倒带系统，蛋白质含有七对二硫键。在大肠杆菌中表达促肌蛋白酶，并形成不溶性包容体。除了常用的大肠杆菌菌株BL21（DE3）恒星（Invitrogen）外，我们还试图产生Rosetta-Gami B（De3）（De3）（Novagen），这是一种突变的大肠杆菌，在所有条件下都形成了可以形成宿主的细胞内二硫化物形成。因此，研究了各种条件以进行溶解和放松，并发现大多数蛋白酶刺激激素多肽链通过贬低和用6M鸟苷盐酸盐和溶解而形成与天然形式相同的二聚体，然后通过稀释循环恢复。然后，通过两步柱色谱法纯化了这种刺激性的促假酮激素，并进行了生物活性测定，并且具有与制剂的特定活性相等。因此，也可以成功形成含有七对二硫键蛋白质的蛋白质的三维结构，即刺激性激素。当前，我们正在使用该放松味获得的蛋白酶刺激激素进行结晶实验，我们计划使用X射线晶体学进行3D结构分析。