膜タンパク質の高効率立体構造解析をめざした発現系作成から結晶化までのシステム構築

从表达系统创建到结晶的系统构建，用于高效膜蛋白三维结构分析

基本信息

批准号：
17681026
负责人：
永田宏次
金额：
$ 19.55万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17681026/
关键词：
membrane protein Thermus thermophilus Aeropyrum pernix high-throughput expression structural genomics

项目摘要

平成18年度は、平成17年度に引き続き原核生物の膜タンパク質を大腸菌を宿主として発現させる系について検討する一方で、新たに真核生物の膜タンパク質を酵母を宿主として発現させる系について検討した。原核生物の膜タンパク質については、好熱細菌Thermus thermophilusと好熱古細菌Aeropyrum pernix岳の膜タンパク質、各53個、計106個について、pBAD(araBADプロモーター、Invitrogen)とpET-Mistic(T7プロモーター、枯草菌Bacillus subtilis由来の4回膜貫通型膜タンパク質Mistic(Roosild et al.,2005)との融合タンパク質発現ベクター、Novagen製品を改変)とに組み込むことを計画したが、一部の膜タンパク質遺伝子のベクターへの導入に難航し、結局pBADベクターに27個の膜タンパク質遺伝子を組み込み、その発現確認実験を行った。その結果、Flagタグ抗体を用いたWestern blotで、27個のうち15個の膜タンパク質について発現が確認された。特に、複数の輸送体膜タンパク質の発現量が非常に高いことが示され、結晶化用試料の調製が可能になった。真核生物の膜タンパク質については、ヒト、カイコガ、線虫、シロイヌナズナ、酵母の膜タンパク質、約50個を対象とした。膜タンパク質発現量の確認を効率のよく行うため、[α-mating factorのシグナル配列]-[膜タンパク質]-[GFP]を酵母S.cerevisiaeで発現させるベクターを構築した。現在、上記真核生物の膜タンパク質の発現確認を進めている。

2006年，继2005年之后，我们研究了以大肠杆菌为宿主表达原核膜蛋白的系统，并且还研究了以酵母为宿主表达真核膜蛋白的新系统。关于原核生物的膜蛋白，pBAD（araBAD 启动子，Invitrogen）和 pET-Mistic（T7 启动子，枯草芽孢杆菌 Mistic，来自枯草芽孢杆菌的四次跨膜膜蛋白（Roosild 等，2014）。我们计划将融合蛋白表达载体整合到融合蛋白表达载体（改良的Novagen产品）中，但是很难将一些膜蛋白基因引入到载体中，最终我们将27个膜蛋白基因插入到pBAD载体中插入基因并进行实验以确认其表达。结果，使用 Flag 标签抗体的蛋白质印迹证实了 27 种膜蛋白中 15 种的表达。特别是，多种转运膜蛋白的表达水平极高，使得制备用于结晶的样品成为可能。关于真核膜蛋白，我们针对来自人类、蚕蛾、线虫、拟南芥和酵母的大约 50 种膜蛋白。为了有效确认膜蛋白的表达水平，我们构建了在酿酒酵母中表达[α-交配因子信号序列]-[膜蛋白]-[GFP]的载体。我们目前正在确认上述真核膜蛋白的表达。