カイコ前胸腺刺激ホルモンの立体構造解析と機能相関

家蚕前胸激素的结构分析及功能关系

基本信息

批准号：
09265219
负责人：
永田宏次
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09265219/
关键词：
前胸腺刺激ホルモン(PTTH)巻きもどし NMR 結晶化

项目摘要

大腸菌で発現したPTTHの大規模精製系の確立-6xHis-tev-PTTHはPTTHの発現の場合と同じく封入体を形成した。従来法では、PTTHの封入体を8M尿素で可溶化した後、透析して巻き戻していたが、分子会合・沈殿を抑えるためにPTTH濃度を低くする必要があった(【less than or equal】30 μg/ml)。それゆえ、大容量の希薄タンパク質溶液を扱うこの方法は、大量調製には不向きであった。そこで、タンパク質間相互作用を抑えるために、6xHis-tev-PTTHをNi-NTA agaroseに結合させた状態で巻き戻したところ、6xHis-tev-PTTHが1mg/mlの高濃度であっても、会合・沈殿を抑えて、目的のホモダイマーを主産物として得ることができた。したがって従来法の1/30の液量で巻き戻しが可能になり、大腸菌で発現したPTTHの大量調製が効率的に行えるようになった。発現PTTHの大量調製法が確立したので、今後、結晶化条件の検討をPTTHの2D^1_-HNMR解析-NMR法による立体構造解析は、結晶化を必要とせず、さらに、比較的初期に二次構造を決定できるので、X線結晶構造解析と相補的な構造解析手段である。NMR法によるPTTHの立体構造解析を進めるために、H_2O(pH6.0、HCI添加によりpH調整)に溶解した2mMPTTHの2D^1_-HNMRを測定した。broadなNMRシグナルとsharpなものが混在することから、PTTH分子がrigidなコア構造とflexibleな周辺部からなることが明らかになった。スペクトルの質から、安定同位体(^<13>C,^<15>N,^2H)標識PTTHを用いることで、NMR法による構造決定が可能なことが示された。

在ptth表达的情况下，建立了在coli-6xhis-tev-ptth中表达的PTTH的大规模纯化系统。在常规方法中，用8M尿素溶解PTTH的封闭体，透析为透析，但是有必要降低PTTH浓度以抑制分子会议和沉积物（小于或相等）。30μg/ml）。因此，处理大容量薄蛋白溶液的方法不适合质量制备。因此，为了抑制蛋白质之间的相互作用，6xhis-tev-ptth被与Ni-NTA琼脂糖结合的结合状态被重新扭转，即使6xhis-tev-pth是1 mg/ml，它也会遇到。能够通过抑制沉淀来获得所需的同型二聚体作为主要产物。因此，通过1/30液体量的常规方法可以重新恢复，并且可以有效地进行大肠杆菌中表达的大量PTTH。由于已经建立了大批量的表达PTTH方法，因此PTTH-NMR方法的2D^1_-HNMR分析将来不需要结晶，并且在早期就不需要结晶可以确定下一个结构，即X射线晶体结构分析和互补的结构分析平均值。为了通过NMR方法促进PTTH三维结构分析，测量了溶解在H_2O（pH6.0，通过添加HCI）中的2mptth 2d^1_-HNMR。宽NMR信号的混合物和清晰的信号的混合物表明，PTTH分子由刚性核心结构和柔性外围组成。光谱的质量表明，可以使用符号PTTH通过NMR方法确定稳定的同位素（^<13> c，^<15> n，^2h）。