カイコ前胸腺刺激ホルモンの立体構造解析と機能相関

家蚕前胸激素的结构分析及功能关系

基本信息

批准号：
09265219
负责人：
永田宏次
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09265219/
关键词：
前胸腺刺激ホルモン(PTTH)巻きもどし NMR 結晶化

项目摘要

大腸菌で発現したPTTHの大規模精製系の確立-6xHis-tev-PTTHはPTTHの発現の場合と同じく封入体を形成した。従来法では、PTTHの封入体を8M尿素で可溶化した後、透析して巻き戻していたが、分子会合・沈殿を抑えるためにPTTH濃度を低くする必要があった(【less than or equal】30 μg/ml)。それゆえ、大容量の希薄タンパク質溶液を扱うこの方法は、大量調製には不向きであった。そこで、タンパク質間相互作用を抑えるために、6xHis-tev-PTTHをNi-NTA agaroseに結合させた状態で巻き戻したところ、6xHis-tev-PTTHが1mg/mlの高濃度であっても、会合・沈殿を抑えて、目的のホモダイマーを主産物として得ることができた。したがって従来法の1/30の液量で巻き戻しが可能になり、大腸菌で発現したPTTHの大量調製が効率的に行えるようになった。発現PTTHの大量調製法が確立したので、今後、結晶化条件の検討をPTTHの2D^1_-HNMR解析-NMR法による立体構造解析は、結晶化を必要とせず、さらに、比較的初期に二次構造を決定できるので、X線結晶構造解析と相補的な構造解析手段である。NMR法によるPTTHの立体構造解析を進めるために、H_2O(pH6.0、HCI添加によりpH調整)に溶解した2mMPTTHの2D^1_-HNMRを測定した。broadなNMRシグナルとsharpなものが混在することから、PTTH分子がrigidなコア構造とflexibleな周辺部からなることが明らかになった。スペクトルの質から、安定同位体(^<13>C,^<15>N,^2H)標識PTTHを用いることで、NMR法による構造決定が可能なことが示された。

建立在大肠杆菌-6xhis-Tev-ptth形成的包含体中表达的大规模纯化系统，类似于PTTH表达。在常规方法中，将PTTH包含体用8M尿素溶解，然后透析以放松，但是有必要降低PTTH浓度以抑制分子缔合和沉淀（[小于或等于]30μg/ml）。因此，这种处理大量稀蛋白溶液的方法不适合大量制备。因此，为了抑制蛋白质 - 蛋白质相互作用，与Ni-NTA琼脂糖结合的6xHis-TEV-PTTH被倒回去，即使在高浓度的6xHis-TEV-PTTH中，也可以抑制1 mg/ml的6xHis-TEV-PTTH，并且可以抑制缔合和降水，并且可以作为主要产物获得靶同二聚体。因此，可以用常规方法的1/30液体液体积放松，从而有效制备大型大肠杆菌中表达的大量PTTH。作为一种准备大量表达PTTH的方法，PTTH的2d^1_-HNMR分析-NMR方法是研究未来的结晶条件，以及通过2D^1_-HNMR分析-NMR方法对PTTH进行的3D结构分析不需要结晶，并且可以进一步确定二级结构，以使其对二级分析进行相关的结构分析，以使其成为构造的结构分析。为了通过NMR进行PTTH的3D结构分析，测量了溶解在H_2O（pH 6.0，由HCI添加调整的pH）中的2mptth的2D^1_-HNMR。宽NMR信号和尖锐信号的混合物表明，PTTH分子由刚性核心结构和柔性外围区域组成。光谱质量表明，使用稳定的同位素（^<13> c，^<15> n，^2h）标记为PTTH，可以通过NMR进行结构测定。